快速檢測豬2型圓環(huán)病毒的實時熒光rpa試劑盒、試紙條rpa試劑盒及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測豬2型圓環(huán)病毒的試劑盒及其用途，特別涉及一種基于RPA反 應(yīng)的用于快速檢測豬2型圓環(huán)病毒的實時熒光RPA試劑盒以及試紙條RPA試劑盒，還涉及二 者在快速檢測豬2型圓環(huán)病毒中的用途，本發(fā)明屬于預(yù)防獸醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 自PCR技術(shù)誕生以來已經(jīng)有三十年了。從經(jīng)典PCR、實時定量PCR再到現(xiàn)在的數(shù)字 PCR，這一技術(shù)在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。但是該技術(shù)需要特殊昂貴的熱循環(huán)儀器 以及熟練的操作人員，費時費力，難以用在現(xiàn)場診斷以及實驗條件差的地方。在發(fā)展中國家 實驗室中，由于PCR實施所需要的基礎(chǔ)設(shè)備和技術(shù)所限，大多數(shù)發(fā)展中國家仍然集中在使用 傳統(tǒng)的試驗方法，比如血清學(xué)方法、顯微鏡技術(shù)，或者培養(yǎng)以及鑒定傳染性以及非傳染性疾 病。為了填補(bǔ)傳統(tǒng)方法和PCR之間的空缺，新的等溫分子診斷技術(shù)正在開發(fā)，該方法尤其適 用于基礎(chǔ)設(shè)施、實驗設(shè)備以及試驗技術(shù)難于支持使用PCR進(jìn)行診斷的地方。
[0003] 與常規(guī)方法相比較，等溫擴(kuò)增實驗具有很高的敏感性和特異性，這些原因促使不 同的公司商業(yè)化不同的等溫擴(kuò)增技術(shù)，比如，環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增(LAMP;Eiken，日本），RPA(RPA; Alere,USA and TwistDx,UK)，鏈置換擴(kuò)增（strand displacement amplification，Becton Dickson, USA)。在這些技術(shù)中，LAMP是使用最為廣泛，且最成熟的試驗方法。與RPA方法相比 較，LAMP技術(shù)具有試驗設(shè)計比較麻煩(3對引物），特異性相對較弱（能擴(kuò)增很多條帶），時間 仍然相對較長，以及易于污染等不足的地方。
[0004] 英國TwistDx Inc公司開發(fā)的重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase 八1]^11;^〇&1:;[011，1^^)被稱為是可以替代?0?的核酸檢測技術(shù)。以此為基礎(chǔ)的丁\/151八111|3 :? 核酸擴(kuò)增產(chǎn)品能夠在15分鐘內(nèi)，37°C_42°C之間進(jìn)行核酸檢測?，F(xiàn)在使用最多的、最為成熟 的為進(jìn)行實時監(jiān)控的體系（如了你丨51八1耶(^^0試劑盒，代31-1:;[1116 1^4)以及基于試紙條的 終點檢測（T\vistAmp?nfo試劑盒，Recombinase Polymerase Amplification Assay combined with lateral flow test，LFS RPA)0
[0005] 實時熒光RPA(real-time RPA)試驗需要能激發(fā)并檢測熒光基團(tuán)的恒溫儀器，比如 酶標(biāo)儀或?qū)崟r檢測的熱循環(huán)儀。自開發(fā)以來，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到人類疾病、獸醫(yī)藥 物、食品工業(yè)以及農(nóng)業(yè)中，比如用于土拉弗朗西斯菌、細(xì)螺旋體、HIV-1DNA、鼠疫桿菌、炭疽 桿菌、天花病毒、B型鏈球菌、大腸桿菌產(chǎn)生的志賀毒素、中東呼吸綜合征冠狀病毒、裂谷熱 病毒、口蹄疫病毒、牛冠狀病毒、埃博拉病毒、蘇丹病毒、馬爾堡病毒、施馬倫貝格病毒、牛病 毒性腹瀉病毒、黃熱病毒以及戈登病毒等病原的檢測。
[0006] 對于試紙條RPA(LFS RPA)試驗而言，只要溫度能控制在37_42°C之間就行，比如可 以在水浴鍋等設(shè)置中進(jìn)行反應(yīng)，或者直接用人的體溫進(jìn)行加熱，隨后可以通過側(cè)流層析試 紙條LFS(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)讀取試驗結(jié)果。自開發(fā)以來，該 技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到人類疾病、獸醫(yī)藥物、食品工業(yè)以及農(nóng)業(yè)中，比如用于感染性皮下 及造血組織壞死病毒（IHHNV)、惡性瘧原蟲、洋李痘皰病毒、羌蟲、力克次體、隱孢子蟲以及 黃熱病毒等的檢測。與常規(guī)方法相比較，該實驗具有很高的敏感性和特異性。
[0007] 豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬的成員，PCV 是小的、無囊膜的DNA病毒，直徑大約為17納米。根據(jù)DNA序列、抗原性以及致病性可將其分 為兩個不同的基因型一 PCV1和PCV21CV1被認(rèn)為不具有致病性，并且在豬腎細(xì)胞系(PK-15) 中持續(xù)感染?？墒牵琍CV2斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)的主要病原，表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)損 失，淋巴細(xì)胞減少、淋巴結(jié)腫大等病變，同時引發(fā)其他病原的繼發(fā)感染，目前已成為嚴(yán)重阻 礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病原之一。進(jìn)一步來說，PCV2是一種免疫抑制病毒，感染該病毒的豬更 容易被其他病毒或者細(xì)菌感染。調(diào)查顯示，PCV2在豬體內(nèi)廣泛存在。因此，建立一種快速、簡 單、特異、敏感的檢測方法來檢測PCV2對于該病的防控起著關(guān)鍵的作用。
[0008] Zhou等（Zhou，S·，et al.,Loop-mediated isothermal amplification for detection of porcine circovirus type 2.Virol J,2011 ·8:ρ·497·)公開了一種檢測豬 2型圓環(huán)病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法。通過LAMP的擴(kuò)增結(jié)果表明，該方法能夠出現(xiàn)很多擴(kuò)增條 帶，因此該方法存在非特異性擴(kuò)增，而且該方法需要設(shè)計三對引物來進(jìn)行擴(kuò)增，因此增加了 實驗設(shè)計的難度，并且增加了其與其他檢測平臺相結(jié)合的難度。并且檢測溫度較高(63°C)， 檢測時間較長(60min)。并且需要核酸電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，增加了污染的可能性。
[0009] Yang等（Yang，Z.Z.，et al·，Detection of PCV2DNA by SYBR Green I-based quantitative PCR. J Zhejiang Univ Sci B，2007 · 8(3): p · 162-9 ·)公開了一種基于SYBR green I的用于檢測PCV2DNA的實時熒光定量PCR法。該方法需要復(fù)雜的試驗設(shè)備以及熟練 的操作人員，該方法需要較長的試驗時間（大約1.5h)。由于SYBR Green I非特異性結(jié)合所 有的雙鏈DNA，因此，該方法的特異性相對較差。
[0010] 本發(fā)明針對豬2型圓環(huán)病毒的0RF2基因，建立并評估了基于熒光探針的RPA(real-time RPA)檢測試劑盒以及基于試紙條的LFS RPA檢測試劑盒以實現(xiàn)快速檢測豬2型圓環(huán)病 毒的目的，據(jù)我們所知，國內(nèi)外尚無建立這樣的試劑盒用于檢測豬2型圓環(huán)病毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能快速、簡單、特異的鑒定豬2型圓環(huán)病毒 的檢測方法及試劑盒。
[0012] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
[0013]本發(fā)明發(fā)明人針對豬2型圓環(huán)病毒的0RF2基因設(shè)計引物和探針。同時通過對來自 于 GenBank中的 KR559725.1、KR559695.1、KM455975.1、KP768481.1、JN181905.1、 JN181902.1、KF850461.1、KC620515.1、KF035059.1、KF951567.1、KF951570.1、ΚΜ624031.1 和JQ002672.1的0RF2基因同源序列進(jìn)行比對分析，進(jìn)一步確定了豬2型圓環(huán)病毒0RF2基因 的保守區(qū)域，針對該區(qū)域設(shè)計引物和探針，以期能夠檢測到盡可能多的豬2型圓環(huán)病毒。所 有的引物和探針都由生工生物(上海，中國）合成。本發(fā)明分別設(shè)計合成了三對上游引物和 三對下游引物，通過對引物與探針組合進(jìn)行擴(kuò)增效果評價，最終將其中一對能夠產(chǎn)生最強(qiáng) 的擴(kuò)增信號的引物對與探針組合應(yīng)用到本發(fā)明中。針對實時熒光RPA(real-time RPA)與試 紙條RPA(LFS RPA，Recombinase Polymerase Amplification Assay combined with lateral flow test)的不同檢測特點，本發(fā)明分別設(shè)計了用于豬2型圓環(huán)病毒檢測的實時 熒光RPA以及試紙條RPA檢測的引物和探針序列，該兩種試劑盒針對同一靶標(biāo)序列，但引物 和探針的修飾堿基和檢測平臺不同。
[0014]本發(fā)明一種用于快速檢測豬2型圓環(huán)病毒的實時焚光RPA(real-time RPA)檢測試 劑盒，包括有一對引物和一條探針，
[0015]其中，所述的一對引物和一條探針的序列如下所示：
[0016] 上游引物：5'-AAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCA-3'（SEQ ID N0.1 所示）
[0017] 下游引物：5'-TTGTATTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAACGC-3'（SEQIDN0·2所示）
[0018] 探針：5 ' -ATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTG
[0019] -FAM-dT-G-THF-C-BHQl-dT-GAGACTACAAACTGC-P-3'（SEQIDN0.3K*)
[0020] 其中，F(xiàn)AM-dT表示攜帶有熒光素基團(tuán)的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氫呋喃連接 子，BHQl-dT表示攜帶有熒光淬滅基團(tuán)M1Q1的胸腺嘧啶核苷酸，P表示磷酸，用于阻止鏈的延 伸。
[0021] 在本發(fā)明所述的實時熒光RPA檢測試劑盒中，優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括水解緩 沖液，醋酸鎂以及ddH20。
[0022] 使用本發(fā)明所述的實時熒光RPA檢測試劑盒檢測豬2型圓環(huán)病毒，優(yōu)選的，反應(yīng)體 系如下：14.75yL的水解緩沖液，1.05yL的ΙΟμΜ上游引物，1.05yL的ΙΟμΜ下游引物，0.075yL 的ΙΟμΜ探針，2yL的病毒DNA模板，4.825yL的ddH20以及1.25yL的280mM醋酸鎂；
[0023] 擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為37_39°C的實時熒光定量PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)時間為20min_ lh，結(jié)束后通過Mx3005P軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。
[0024] 更優(yōu)選的，擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為37°C的實時熒光定量PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)時間為 20min，結(jié)束后通過Mx3005P軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。<