用于生物樣品中的具有提高的性能的timp2測定的制作方法
【專利說明】用于生物樣品中的具有提高的性能的ΤIMP2測定
[0001] 本申請要求2013年8月7日提交的美國臨時專利申請61/863,073的優(yōu)先權(quán)，所述申 請整體并入本文，包括所有表格、附圖和權(quán)利要求。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] W下發(fā)明背景論述僅提供來幫助讀者理解本發(fā)明，并且并非承認描述或構(gòu)成本發(fā) 明的現(xiàn)有技術(shù)。
[0004] 金屬蛋白酶抑制劑2(Swiss-Prot P16035，又稱為"金屬蛋白酶組織抑制劑2"和 "TIMP2")是與金屬蛋白酶復(fù)合并且通過結(jié)合至其催化鋒輔助因子而使其不可逆地失活的 分泌蛋白。T IMP 2 已知會對 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-13、MMP-14、匪P-15、匪P-16W及MMP-19起作用。TIMP2據(jù)報道會壓制內(nèi)皮細胞的增殖。因此，已表明 編碼蛋白會通過W下方式對組織動態(tài)平衡的維持產(chǎn)生一定的作用：響應(yīng)于血管生成因子而 壓制靜態(tài)組織的增殖，并且抑制經(jīng)受重建的組織的蛋白酶活性。
[0005] 此外，W02010/048346和W02011/075744(各自W引用的方式整體并入本文，包括所 有表格、附圖和權(quán)利要求)描述了將TIMP2單獨地且W多標志物組方式用于評價受試者的腎 狀況。具體而言，通過免疫測定測量的TIMP2水平顯示與腎狀況的風(fēng)險分級、診斷、分期、預(yù) 后、分類W及監(jiān)控相關(guān)。
[0006] 從特異性結(jié)合測定諸如免疫測定獲得的信號是一種或多種結(jié)合物質(zhì)（例如，抗體） 與祀生物分子（即，分析物)和含有抗體所結(jié)合的必要表位的多膚之間形成復(fù)合物的直接結(jié) 果。免疫測定往往能夠"檢測"分析物;但由于抗體表位大約是8個氨基酸，所W被配置來檢 測相關(guān)標志物的免疫測定還將檢測與標志物序列相關(guān)的多膚，只要那些多膚含有結(jié)合至測 定中所使用的一個或多個抗體所需的表位即可。雖然運類測定可W檢測全長生物標志物并 且將測定結(jié)果表述為相關(guān)生物標志物的濃度，但是來自測定的信號實際上是源于樣品中存 在的所有運類"免疫反應(yīng)性"多膚。運類結(jié)合測定還可W檢測生物樣品中存在的與另外的物 質(zhì)諸如結(jié)合蛋白質(zhì)、受體、肝素、脂質(zhì)、糖等復(fù)合的免疫反應(yīng)性多膚，前提是那些另外的物質(zhì) 不干擾結(jié)合物質(zhì)與祀生物分子之間的結(jié)合。然而，通常，特異性結(jié)合測定是使用純化分析物 來配制，而不考慮復(fù)雜的形成和斷裂模式。運在運類另外的結(jié)合物質(zhì)的身份未知的情況下 尤其如此。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供尤其是在用于評價腎損傷時具有提高的臨床性能的TIMP2免 疫測定。確切地說，我們描述了當(dāng)用于復(fù)雜的臨床樣本諸如生物流體時，且尤其是用于快速 測定模式時展現(xiàn)出提高的測定性能的抗體和抗體對的選擇和使用。
[000引在第一方面，本發(fā)明設(shè)及一種或多種特異地結(jié)合人TIMP-2的分離的單克隆抗體， 其中每一種分離的單克隆抗體W至少i08m-i的親和力結(jié)合至多膚，所述多膚的序列由選自 由W下組成的組的序列組成：
[0009] QAFCNADWIRAKAVS邸EVD(SEQ ID N0:1)、
[0010] lYGNPIKRIQYEIKQI(沈Q ID N0:2)、
[0011] YEIKQIKMFKGP邸DIEFIYTAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKAEGDG(SEQ ID N0:3)、
[0012] YEIKQIKMFKGP邸DIEFIYTAPSSAV(SEQ ID NO:4)、
[0013] EFIYTAPSSAVCGVS(SEQ ID N0:5)、
[0014] TAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKA(SEQ ID N0:6)、
[0015] SLDVGGKKEYLIAGKAEGDGK(SEQ ID N0:7)、
[0016] SSPDE化WMDWVT邸NING冊（SEQ ID N0:8)W及
[0017] CAWYRGAAPPKQEFLDIEDP(SEQ ID N0:9)〇
[0018] 用于要求保護的方法的抗體可W獲自多種物種。例如，本發(fā)明的抗體可W包含免 疫球蛋白序列，所述免疫球蛋白序列是兔、小鼠、大鼠、豚鼠、雞、山羊、綿羊、驢、人、美洲駝 或駱駝科動物序列、或運類序列的組合(所謂的嵌合抗體）。運類抗體也可W是單克隆的或 多克隆的。用于本發(fā)明的抗體可W通過其在免疫測定中的性能來鑒別，并且之后進一步通 過表位定位來表征W便理解與所述性能有關(guān)的表位。
[0019] 表位通常由分子的化學(xué)活性表面基團（諸如氨基酸或糖側(cè)鏈)組成，并且通常具有 特定Ξ維結(jié)構(gòu)特征，W及特定電荷特征。構(gòu)型性W及非構(gòu)型性表位差別在于:在變性溶劑存 在下，對構(gòu)型性表位的結(jié)合喪失，而不是非構(gòu)型性表位。優(yōu)選地，表位選自SEQ ID N0:l-9當(dāng) 中，所述表位各自是獲自人TIMP2序列的序列。用于本發(fā)明的優(yōu)選的抗體特異地結(jié)合至運些 膚中的一個或多個。
[0020] 運類單克隆抗體可W綴合至信號發(fā)生成分（signal development element)或固 定在固體支持物上。此外，運類抗體可W用于許多競爭測定和夾屯、測定模式。
[0021] 通過舉例，在競爭模式中，運些優(yōu)選抗體中的一種或多種可W綴合至信號發(fā)生成 分W提供可檢測標記抗體。生物樣品中的TIMP2可W與固定在測試裝置的預(yù)定區(qū)處的TIMP2 競爭結(jié)合至所述抗體，并且預(yù)定區(qū)處獲得的信號的量將與樣品中的TIMP2的量成反比?？商?代地，TIMP2可W綴合至信號發(fā)生成分W提供可檢測標記分析物。生物樣品中的TIMP2可W 競爭結(jié)合至固定在測試裝置的預(yù)定區(qū)處的抗體，并且預(yù)定區(qū)處獲得的信號的量將再次與樣 品中的TIMP2的量成反比。
[0022] 在夾屯、測定的實例中，第一抗體(可檢測標記的）和第二抗體（固定在測試裝置的 預(yù)定區(qū)處)在測試裝置的預(yù)定區(qū)處與樣品中的TIMP2形成夾屯、復(fù)合物。在夾屯、測定中，第一 抗體和第二抗體可W是相同的（尤其是在使用多克隆抗體時)或不同的。因此，本發(fā)明的抗 體可W用于夾屯、對，或可W單獨地與非為單克隆抗體諸如多克隆單體或適體的另一種結(jié)合 實體一起使用。
[0023] 本發(fā)明的抗體可W用作測試試劑盒中用于檢測生物樣品中的TIMP-2的試劑。運種 測試試劑盒可W例如包括一次性測試裝置，所述一次性測試裝置被配置來產(chǎn)生與生物樣品 中的人TIMP-2的存在或量有關(guān)的可檢測信號?？商娲兀\種測試試劑盒可W被配制用于 在未利用一次性測試裝置的臨床分析器中執(zhí)行測定。優(yōu)選地，測試試劑盒是體外診斷。如本 文所使用的術(shù)語"體外診斷的"指代無論是單獨使用還是組合使用生產(chǎn)商都意圖體外使用 來檢測來源于人體的試樣(包括血液和組織捐贈品）的醫(yī)療裝置，所述醫(yī)療裝置為試劑、試 劑產(chǎn)品、校準器、控制材料、試劑盒、儀器、設(shè)備、器材或系統(tǒng)，所述醫(yī)療裝置僅僅或主要是為 了提供與生理學(xué)或病理學(xué)狀態(tài)有關(guān)的、或與先天性異常有關(guān)的信息，或者確定潛在接受體 的安全和相容性，或監(jiān)控治療性措施。
[0024] 在某些實施方案中，免疫測定W側(cè)流模式執(zhí)行。側(cè)流測試是免疫測定的一種形式， 其中測試樣品W色譜方式沿吸水性或非吸水性多孔固體襯底流動。側(cè)流測試可W操作為競 爭或夾屯、模式測定。優(yōu)選的側(cè)流裝置是一次性的、單次使用測試裝置。在涂覆區(qū)將樣品涂覆 到測試裝置上并且使所述樣品經(jīng)過襯底，在所述襯底處，所述樣品與已用抗體或抗原預(yù)處 理的線或區(qū)接觸。如本文所使用的術(shù)語"測試區(qū)"指代側(cè)流測試條上接受詢查W便于產(chǎn)生與 相關(guān)分析物的存在或量有關(guān)的信號的離散位置?？蓹z測信號可W通過將一次性測試裝置插 入到分析儀器諸如反射計、巧光計或透射光度計中來視覺讀取或獲得。運個清單并非意味 著要限制。樣品可W在未預(yù)處理的情況下涂覆到涂覆區(qū)上，或可W在涂覆之前與一種或多 種測定試劑預(yù)混合。在后一種情況下，抗體可W提供在與一次性測試裝置分開的容器中。
[0025] 本發(fā)明的抗體可W分散性地固定到一次性測試裝置內(nèi)的表面上，W使得抗體在樣 品接觸表面時溶解到所述樣品中。在夾屯、測定模式中，運種分散性結(jié)合的抗體可W結(jié)合至 樣品中所述抗體的同源抗原，并且之后在抗原被檢測區(qū)處非分散性地結(jié)合的第二抗體結(jié)合 時固定在所述檢測區(qū)處。在競爭模式中，樣品中所述抗體的同源抗原可W與提供為測試試 劑的標記抗原競爭結(jié)合至分散性結(jié)合的抗體。
[0026] 本發(fā)明的試劑盒還可W包括用于使可檢測信號與TIMP-2的濃度相關(guān)的校準。通過 舉例，校準曲線可W提供在由接收一次性測試裝置的分析儀器讀取的電子存儲器裝置上， 諸如ROM忍片、閃存驅(qū)動器、RFID標簽等?？商娲兀是€可W提供在編碼標記上，所述 編碼標記被光學(xué)(諸如二維條形碼)讀取，或經(jīng)由網(wǎng)絡(luò)連接傳輸。分析儀器之后可W使用運 個校準曲線來使來自測定的可檢測信號與TIMP-2濃度相關(guān)。
[0027] 在某一實施方案中，使用本發(fā)明的一種或多種抗體執(zhí)行的測定方法提供與生物樣 品中的人TIMP-2的存在或量有關(guān)的信號，其中測定方法中的TIMP-2的最小可檢測濃度是 1 Ong/mL或更小、更優(yōu)選地1 ng/mL或更小W及最優(yōu)選地0.1 ng/mL或更小。
[0028] 在優(yōu)選方面，本發(fā)明提供用于確定生物樣品中的人TIMP2的存在或量的方法，所述 方法包括：
[0029] 用與人TIMP2-起形成夾屯、復(fù)合物的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體對所述生 物樣品執(zhí)行免疫測定，其中所述免疫測定提供與所述生物樣品中結(jié)合在所述夾屯、復(fù)合物中 的人TIMP2的存在或量有關(guān)的可檢測信號；W及
[0030] 使所述可檢測信號與所述生物樣品中的人TIMP2的所述存在或量相關(guān)。優(yōu)選地，免 疫測定中的TIMP-2的最小可檢測濃度是lOng/mL或更小、更優(yōu)選地Ing/mL或更小W及最優(yōu) 選是0.1 ng/mL或更小。
[0031] 在特別優(yōu)選的實施方案中，第一單克隆抗體和第二單克隆抗體中的一種或兩種是 特異地結(jié)合人TIMP-2的更為分離的單克隆抗體，其中每一種分離的單克隆抗體W至少10 8M ^的親和力結(jié)合至多膚，所述多膚的序列由選自由W下組成的組的序列組成：
[0032] QAFCNADWIRAKAVS邸EVD(SEQ ID N0:1)、
[0033] lYGNPIKRIQYEIKQI(沈Q ID N0:2)、
[0034] YEIKQIKMFKGP邸DIEFIYTAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKAEGDG(SEQ ID N0:3)、
[0035] YEIKQIKMFKGP邸DIEFIYTAPSSAV(SEQ ID NO:4)、
[0036] EFIYTAPSSAVCGVS(SEQ ID N0:5)、
[0037] TAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKA(SEQ ID N0:6)、
[00；38] SLDVGGKKEYLIAGKAEGDGK(SEQ ID N0:7)、
[0039] SSPDE化WMDWVT邸NING冊（SEQ ID N0:8)W及
[0040] CAWYRGAAPPKQEFLDIEDP(SEQ ID N0:9)〇
[0041] 優(yōu)選的測定方法包括執(zhí)行檢測人TIMP-2的免疫測定。運類免疫測定可W包括將所 述體液樣品與檢測標志物的抗體相接觸，并且檢測與所述抗體的結(jié)合。雖然本發(fā)明總體是 在免疫測定方面描述，但不基于免疫球蛋白支架的其他結(jié)合實體(例如，適體)也可W使用 來代替運類方法中的抗體。優(yōu)選地，體液樣品選自由尿液、唾液、血液、血清W及血漿組成的 組，并且最優(yōu)選地是尿液。
[0042] 本公開的一個或多個實施方案的細節(jié)列舉在W下附圖和描述中。通過描述和附圖 并且通過權(quán)利要求書，本公開的其他特征、目的和優(yōu)點將顯而易見。
[0043] 發(fā)明詳述
[0044] 定義
[0045] ^文所使用，術(shù)語"金屬蛋白酶抑制劑2"和"TIMP-2"指代生物樣品中存在的衍 生自金屬蛋白酶抑制劑2前體(人前體:5巧133斗'〇巧16035(560 10顯：10))的一種或多種 多膚。
[0046]
[0047] 已鑒別金屬蛋白酶抑制劑2中的W下結(jié)構(gòu)域：
[004引殘基長度結(jié)構(gòu)域ID
[0049] 1-26 26 信號膚
[00加]27-220 194金屬蛋白酶抑制劑2
[0051] 除非本文另外確切說明，否則所使用的術(shù)語的定義是藥物科學(xué)領(lǐng)域中使用的標準 定義。如說明書和所附權(quán)利要求書中所使用，除非上下文另外明確規(guī)定之外，否則單數(shù)形式 "一個(a)"、" 一種(an)"和"所述(the)"包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如，提到"藥物載體"包括 兩個或更多個運類載體的混合物等。
[0052] 如本文所使用的術(shù)語"受試者"指代人或非人生物體。因此，本文所描述的方法和 組合物可適用于人和獸醫(yī)疾病。另外，雖然受試者優(yōu)選地是活生物體，但本文所描述的本發(fā) 明同樣可W用于死后分析。優(yōu)選的受試者是人，并且最優(yōu)選地是"患者"，所述患者如本文所 使用指代正接收針對疾病或病狀的醫(yī)療護理的活人。運包括針對病理體征進行研究的未患 有所定義疾病的人。
[0053] 優(yōu)選地，分析物在樣品中進行測量。運種樣品可W獲自受試者，或可W獲自意圖被 提供給受試者的生物材料。例如，樣品可W獲自對受試者體內(nèi)的可能移植正進行評價的腎， 并且分析物測量用于評價腎的已經(jīng)存在的損傷。優(yōu)選的樣品是體液樣品。
[0054] 如本文所使用的術(shù)語"體液樣品"指代出于對相關(guān)受試者諸如患者或移植捐獻者 的診斷、預(yù)后、分類或評價的目的而獲得的體液的樣品。在某些實施方案中，運種樣品可W 出于確定正在發(fā)生的病狀的轉(zhuǎn)歸或治療方案對病狀的影響的目的而獲得。優(yōu)選的體液樣品 包括血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液、疲W及胸腔積液。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識 到某些體液樣品在分級分離或純化程序(例如，將全血分離為血清或血漿組分)之后會更容 易分析。
[0055] 如本文所使用