染色體構(gòu)象劃分產(chǎn)物捕獲的制作方法
【專利說(shuō)明】染色體構(gòu)象劃分產(chǎn)物捕獲
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2014年2月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/939,565號(hào)的優(yōu)先權(quán)，該文 的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用納入本文用于所有目的。
【背景技術(shù)】
[0003] 用于研究染色體體內(nèi)構(gòu)象的技術(shù)已經(jīng)掲示了大量關(guān)于基因調(diào)控機(jī)制的信息。例 如，染色體構(gòu)象研究可掲示通過(guò)遠(yuǎn)程DNA序列元件對(duì)基因的遠(yuǎn)程調(diào)控。一種用于確定染色體 的體內(nèi)構(gòu)象的廣泛使用的方法被稱為染色體構(gòu)象捕獲，或3C。其它技術(shù)延伸3CW提供其它 信息或能夠進(jìn)行更高通量的分析。運(yùn)類技術(shù)包括，例如，伯、5(：、6(：、化-(：、化1?-環(huán)和化1八-PET。
[0004] -般而言，染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)包括固定染色質(zhì)的Ξ維組織的交聯(lián)步驟、內(nèi)切核 酸酶消化步驟、連接步驟和生成核酸分子文庫(kù)的反交聯(lián)步驟。該文庫(kù)含有核酸分子，其中由 于交聯(lián)事件之前的Ξ維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)而鄰近的序列元件在反交聯(lián)事件之后在一級(jí)結(jié)構(gòu)水平 上鄰近。然后可采用各種擴(kuò)增、測(cè)序或其它核酸檢測(cè)方法來(lái)鑒定Ξ維空間上鄰近的序列元 件。
[000引連接步驟可能需要廣泛優(yōu)化W提供合適的核酸分子文庫(kù)。例如，連接交聯(lián)的元件 使得它們存在于同一核酸分子上的分子內(nèi)連接事件一般有利。相反，不交聯(lián)的序列元件連 接的分子間連接事件一般需要避免或最小化。作為另一個(gè)示例，確保在反交聯(lián)之后沒(méi)有發(fā) 生連接是重要的。作為另一個(gè)示例，不充分的連接可能產(chǎn)生提供很少信息的分子文庫(kù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝耸褂脛澐之a(chǎn)物進(jìn)行染色體構(gòu)象捕獲的改進(jìn)方法。在一些情況中，該 方法不需要連接步驟。在一些情況中，該方法改善了連接步驟的效率、完成度或保真性或其 組合。
[0007] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)在細(xì)胞或完整核中相近的染色體DNA 序列元件的方法，包括:a)交聯(lián)細(xì)胞或完整核中的染色體DNA，從而形成交聯(lián)的DNA產(chǎn)物，其 中在細(xì)胞中相近的染色體DNA序列交聯(lián);b)得到交聯(lián)的DNA產(chǎn)物;C)用內(nèi)切核酸酶消化交聯(lián) 的DNA產(chǎn)物W形成含多種交聯(lián)的DNA消化片段的混合物;d)劃分交聯(lián)的DNA消化片段W產(chǎn)生 多個(gè)劃分產(chǎn)物;并且e)檢測(cè)單個(gè)劃分產(chǎn)物中就基因組的一級(jí)序列而言彼此遠(yuǎn)離的2個(gè)或更 多個(gè)DNA序列元件的存在，其中在單個(gè)劃分產(chǎn)物中檢測(cè)到2個(gè)或更多個(gè)DNA序列元件表明所 述2個(gè)或更多個(gè)DNA序列在細(xì)胞或完整核中相近。
[0008] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)在細(xì)胞或完整核中相近的核酸序列元 件的方法，包括:a)交聯(lián)細(xì)胞或完整核中的染色體DNA，從而形成交聯(lián)的DNA產(chǎn)物，其中在細(xì) 胞中相近的核酸序列交聯(lián);b)得到交聯(lián)的DNA產(chǎn)物;C)用內(nèi)切核酸酶消化交聯(lián)的DNA產(chǎn)物W 形成含多種交聯(lián)的DNA消化片段的混合物;d)劃分交聯(lián)的DNA消化片段W產(chǎn)生多個(gè)劃分產(chǎn) 物;并且f)檢測(cè)單個(gè)劃分產(chǎn)物中就基因組的一級(jí)序列而言彼此遠(yuǎn)離的2個(gè)或更多個(gè)核酸序 列元件的存在，其中在單個(gè)劃分產(chǎn)物中檢測(cè)到2個(gè)或更多個(gè)核酸序列元件表明所述2個(gè)或更 多個(gè)核酸序列在細(xì)胞或完整核中相近。
[0009] 在一些方面中，劃分交聯(lián)的DNA消化片段，使得各劃分產(chǎn)物中交聯(lián)的DNA消化片段 的平均數(shù)量為約1或更低。在一些情況中，劃分交聯(lián)的DNA消化片段W產(chǎn)生多個(gè)劃分產(chǎn)物包 括產(chǎn)生至少1000、至少10000、至少20000、至少100000、或至少1000000個(gè)劃分產(chǎn)物。在一些 情況中，劃分產(chǎn)物在體積上小于約10化L、小于約10化或小于約InL。
[0010] 在一些方面中，該方法還包括反交聯(lián)，從而從劃分產(chǎn)物中交聯(lián)的DM消化片段中生 成2個(gè)反交聯(lián)的DNA消化片段。在一些情況中，在消化交聯(lián)的DNA的步驟之后進(jìn)行反交聯(lián)。
[0011] 在一些方面中，檢測(cè)包括檢測(cè)劃分產(chǎn)物中反交聯(lián)的DNA消化片段，其中在單個(gè)劃分 產(chǎn)物中檢測(cè)到2個(gè)反交聯(lián)的DNA消化片段表明運(yùn)2個(gè)反交聯(lián)的DNA消化片段曾交聯(lián)，由此檢測(cè) 到在核中相近的染色體DNA序列元件。在一些情況中，反交聯(lián)包括將劃分產(chǎn)物加熱至至少約 55°C、至少約65°C、或至少約95°C。在一些情況中，反交聯(lián)包括用蛋白酶，如蛋白酶K解育劃 分產(chǎn)物。
[001引在一些方面中，檢測(cè)包括檢測(cè)劃分產(chǎn)物中反交聯(lián)的同時(shí)含有DNA和RNA的DNA消化 片段，其中在單個(gè)劃分產(chǎn)物中檢巧蝴2個(gè)反交聯(lián)的DNA消化片段表明運(yùn)2個(gè)反交聯(lián)的DNA消化 片段曾交聯(lián)，由此檢測(cè)在核中相近的DNA和/或RNA序列元件。在一些情況中，反交聯(lián)包括將 劃分產(chǎn)物加熱至至少約55°C、至少約65°C、或至少約95°C。在一些情況中，反交聯(lián)包括用蛋 白酶，如蛋白酶K解育劃分產(chǎn)物。在一些情況中，檢測(cè)包括逆轉(zhuǎn)錄。
[0013]在一些方面中，多個(gè)劃分產(chǎn)物中的全部、幾乎全部或一部分含有核酸條碼。在一些 情況中，核酸條碼連接到固體支持物。
[0014] 在一些方面中，檢測(cè)包括DM擴(kuò)增。在一些情況中，DNA擴(kuò)增包括PCR。在一些情況 中，DNA擴(kuò)增包括祀向基因座擴(kuò)增(TLA)。在一些情況中，DNA擴(kuò)增包括逆轉(zhuǎn)錄或RT-PCR。在任 意前述的實(shí)施方式、方面或情況中，檢測(cè)步驟可包括核酸測(cè)序。
[0015] 在一些方面中，交聯(lián)完整核中的染色體DNA包括用交聯(lián)劑解育細(xì)胞。在一些方面 中，交聯(lián)完整核中的染色體DNA包括用交聯(lián)劑解育完整核。
[0016] 在一些實(shí)施方式中，可在多個(gè)完整核或含完整核的多個(gè)細(xì)胞上進(jìn)行任意前述方 法。在一些情況中，該方法還包括對(duì)2個(gè)或更多個(gè)核酸(例如，DNA)序列元件的交聯(lián)頻率進(jìn)行 定量，從而對(duì)運(yùn)2個(gè)或更多個(gè)核酸(例如，DNA)序列元件在完整核群中相近的頻率進(jìn)行定量。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含劃分產(chǎn)物的組合物，所述劃分產(chǎn)物含有交 聯(lián)的DNA消化片段。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含劃分產(chǎn)物的組合物，所述劃分產(chǎn) 物含有交聯(lián)的DNA消化片段，該消化片段含有DNA和RNA。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 包含劃分產(chǎn)物的組合物，所述劃分產(chǎn)物含有反交聯(lián)的DNA消化片段，其中反交聯(lián)的DNA消化 片段是下述過(guò)程的產(chǎn)物:交聯(lián)完整核中DNA、用核酸內(nèi)切酶消化DNA、形成含有消化的和交聯(lián) 的DNA的劃分產(chǎn)物并反交聯(lián)。在一些方面中，劃分產(chǎn)物含有反交聯(lián)的DNA消化片段和反交聯(lián) 的RNA或cDNA。在一些方面中，劃分產(chǎn)物還包含DNA擴(kuò)增試劑或核酸測(cè)序試劑。在一些情況 中，DNA擴(kuò)增試劑或核酸測(cè)序試劑包含寡核巧酸引物或DNA聚合酶。在一些情況中，組合物還 包含至少1000、至少10000、至少20000、或至少100000個(gè)劃分產(chǎn)物。在一些情況中，劃分產(chǎn)物 在體積上小于約10化L、小于約10化或小于約InL。
[001引在一些情況中，檢測(cè)劃分產(chǎn)物中2個(gè)或更多個(gè)核酸（例如，DNA、cDNA或RNA)序列元 件的存在可包括檢測(cè)各虛擬劃分產(chǎn)物中的運(yùn)類元件。例如，檢測(cè)到2個(gè)或更多個(gè)具有相同條 碼的核酸序列元件可表示運(yùn)2個(gè)或更多個(gè)核酸序列元件位于相同的劃分產(chǎn)物中并因此在細(xì) 胞或完整核中相近。替代地，劃分產(chǎn)物中的檢測(cè)可指檢測(cè)物理劃分產(chǎn)物。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1顯示了進(jìn)行基于劃分產(chǎn)物的染色體捕獲分析的方法的幾個(gè)實(shí)施方式。
[0020] 圖2顯示了進(jìn)行基于劃分產(chǎn)物的染色體捕獲分析的方法的一個(gè)實(shí)施方式。在該實(shí) 施方式中，雙鏈銜接子寡核巧酸偶聯(lián)到固體支持物顆粒上并被劃分。銜接子寡核巧酸可含 有對(duì)各固體支持物顆粒獨(dú)特的條碼。銜接子寡核巧酸也可含有用于測(cè)序和/或擴(kuò)增的一個(gè) 或多個(gè)限制性位點(diǎn)和引物結(jié)合位點(diǎn)?？捎孟拗菩悦赶宦?lián)的DNA劃分產(chǎn)物并且劃分成條 碼化的劃分產(chǎn)物?？捎孟拗菩悦?例如，熱穩(wěn)定限制性酶)消化銜接子寡核巧酸W生成與交 聯(lián)的DNA片段的一個(gè)或多個(gè)末端相容并連接到交聯(lián)的DNA片段的粘性末端?？珊喜澐之a(chǎn) 物，并且DNA片段任選地去交聯(lián)并擴(kuò)增W生成擴(kuò)增子。然后可對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序W分析染色 體構(gòu)象。
[0021] 圖3顯示了進(jìn)行基于劃分產(chǎn)物的染色體捕獲分析的方法的一個(gè)實(shí)施方式。在該實(shí) 施方式中，單鏈引物寡核巧酸與固體支持物顆粒偶聯(lián)或整合到凝膠支持物顆粒中并被劃 分。該引物寡核巧酸可含有對(duì)于各固體支持物顆粒獨(dú)特的條碼，和可與交聯(lián)的DNA雜交的雜 交區(qū)。雜交區(qū)域可W是，例如所示的隨機(jī)六聚體?？捎孟拗菩悦赶宦?lián)的DNA劃分產(chǎn)物并 且劃分成條碼化的劃分產(chǎn)物?？赏ㄟ^(guò)例如加熱溶解固體或凝膠支持物。交聯(lián)的DNA可去交聯(lián) 并通過(guò)來(lái)自單鏈引物寡核巧酸的隨機(jī)引物擴(kuò)增來(lái)生成擴(kuò)增子。然后劃分產(chǎn)物可被合并。然 后可對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序W分析染色體構(gòu)象。
[0022] 圖4顯示了進(jìn)行基于劃分產(chǎn)物的染色體捕獲分析的方法的幾個(gè)實(shí)施方式。在該實(shí) 施方式中，交聯(lián)的DNA被劃分，并且在一個(gè)或多個(gè)下游加工步驟中將額外的試劑注射到劃分 產(chǎn)物中。
[0023] 定義
[0024] 除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 所理解的同樣含義。參見(jiàn)例如Lackie，DICTIONARY OF CELLAND MOLECULAR BI0L0GY(《細(xì)胞 和分子生物學(xué)詞典》），埃爾斯威爾出版社化Isevier)(第4版2007);Sambrook等，MOLECULAR 化0NING，A LABORATORY MANUAL(《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》），冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(冷泉港， 紐約1989)。術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"或"一種"意在表示"一個(gè)(種)或多個(gè)(種Γ。當(dāng)術(shù)語(yǔ)"包含"及其各種 變體例如"包括"和"含有"位于敘述步驟或要素之前的時(shí)候，是用來(lái)表示添加其它的步驟或 要素是任選的，并且是非排它性的。本發(fā)明的實(shí)踐中可W使用與本文所述類似或等價(jià)的任 何方法、裝置和材料。本文提供的定義是用來(lái)幫助理解本文經(jīng)常用到的某些術(shù)語(yǔ)，不對(duì)本發(fā) 明的范圍構(gòu)成限制。
[002引本文所用術(shù)語(yǔ)"劃分"或"劃分的"指將樣品分為多個(gè)部分或"劃分產(chǎn)物"。劃分產(chǎn)物 可W是固體或流體。在一些實(shí)施方式中，劃分產(chǎn)物是固體劃分產(chǎn)物，例如微通道。在一些實(shí) 施方式中，劃分產(chǎn)物是流體劃分產(chǎn)物，例如液滴。在一些實(shí)施方式中，流體劃分產(chǎn)物（如液 滴)是不互溶的流體(如水和油）的混合物，或乳液。在一些實(shí)施方式中，流體劃分產(chǎn)物(如液 滴)是水性液滴，其被不互溶的運(yùn)載體流體(如油)包圍。在其它實(shí)施方式中，液體劃分產(chǎn)物 是與相鄰水性液滴在物理或化學(xué)上分開(kāi)的水性液滴，使得一個(gè)液滴的內(nèi)容物不會(huì)擴(kuò)散到相 鄰液滴中。
[0026] 術(shù)語(yǔ)"探針"指與目標(biāo)分子特異性相互作用或特異性結(jié)合目標(biāo)分子的分子(例如蛋 白質(zhì)、核酸、適體等）。與目標(biāo)分子特異性相互作用或特異性結(jié)合目標(biāo)分子的分子的非限制 性示例包括核酸(如寡核巧酸）、蛋白質(zhì)（如抗體、轉(zhuǎn)錄因子、鋒指蛋白、非抗體蛋白支架等） 和適體。
[0027] 術(shù)語(yǔ)"染色體"是指細(xì)菌或真核染色體。
[0028] 本文所用的染色體結(jié)構(gòu)包括一級(jí)、二級(jí)、Ξ級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。一級(jí)染色體結(jié)構(gòu)，或一 級(jí)結(jié)構(gòu)是指染色體的核巧酸序列。二級(jí)結(jié)構(gòu)可W指較高水平的結(jié)構(gòu)組織，如雙鏈DNA的雙螺 旋結(jié)構(gòu)，與核小體結(jié)合的雙鏈染色體DNA的11-nm纖維(例如，一串上的珠子），或?qū)盈B和折疊 的11-nm纖維的30-nm纖維。Ξ級(jí)結(jié)構(gòu)是指將30-nm纖維折疊成環(huán)、轉(zhuǎn)角、假結(jié)、結(jié)構(gòu)域或其它 Ξ級(jí)結(jié)構(gòu)元件。在一些情況中，Ξ級(jí)染色體結(jié)構(gòu)可使在染色體的一級(jí)序列中彼此遠(yuǎn)離的DNA 序列元件相近。四級(jí)結(jié)構(gòu)是指2個(gè)或更多個(gè)不同的染色體的分子間組織。在一些情況中，四 級(jí)染色體結(jié)構(gòu)可使在物理上不相連的DNA序列元件相近。本文所用術(shù)語(yǔ)"染色質(zhì)"用于指代 與蛋白質(zhì)或其它核酸結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)染色體。例如，染色質(zhì)可與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、抑制 因子、增強(qiáng)子、聚合酶、修復(fù)酶、甲基化酶、去甲基化酶、非編碼RNA分子等結(jié)合。本文所用術(shù) 語(yǔ)"染色體"涵蓋染色質(zhì)。
[0029] 用于核中2個(gè)核酸序列元件之間的距離時(shí)，術(shù)語(yǔ)"鄰近"是指在Ξ維空間中運(yùn)2個(gè)核 酸序列元件之間的距離。如此，染色體中在一級(jí)序列上接近（例如，在約10、50、100、150、 200、或25化P或更多W內(nèi)）的DNA序列元件總是彼此相近。在一些情況中，在染色體的一級(jí)序 列中彼此遠(yuǎn)離（例如，隔開(kāi)超過(guò)約200、250、300、400、500、1000、1500、2000、5000、10000、 25000、50000、100000、250000、500000 或 lOOOOOObp)的 DNA序列元件可能由于染色體的 Ξ 級(jí) 或四級(jí)結(jié)構(gòu)而彼此相近。在一些