類陽離子脂質(zhì)、轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及陽離子脂質(zhì)以及轉(zhuǎn)基因載體，具體涉及一種同時含有靶向基團(tuán)及熒光 基團(tuán)的[12]aneN3類陽離子脂質(zhì)、含該類陽離子脂質(zhì)的轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因治療是將外源正常的基因通過一定的方法導(dǎo)入靶細(xì)胞，代替或者補(bǔ)償一些缺 陷或者異常的基因以達(dá)到治療的目的?；蛑委煘楹芏嗉膊〉闹委熖峁┝丝赡苄?，如：癌 癥、糖尿病、囊胞性纖維癥、艾滋病、心血管疾病等。
[0003] 基因治療的關(guān)鍵是是要把治療基因高效地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，然而裸露的DNA-般以舒 展的線型螺旋形式存在，體積較大，并且DNA分子本身為帶負(fù)電的陰離子，進(jìn)入細(xì)胞時會與 細(xì)胞膜外層的陰離子之間產(chǎn)生靜電排斥作用。這些不利因素都使得DNA分子在不借助其它 技術(shù)手段的情況下，無法獨(dú)立穿過細(xì)胞膜，因此發(fā)展有效的基因載體是基因治療成功的前 提條件。
[0004] 基因載體包括病毒載體和非病毒載體兩類。病毒載體是一種高效的轉(zhuǎn)染試劑，但 是它存在缺點(diǎn)，如免疫原性、致癌性，基因的大小容易受到病毒所容納的大小限制、同時存 在變異的可能性，因此其安全性令人擔(dān)憂。非病毒載體無免疫原性、便于大規(guī)模生產(chǎn)。但是， 由于目前的大部分基因載體缺乏熒光標(biāo)記基團(tuán)，所以，非病毒載體在細(xì)胞內(nèi)分布以及運(yùn)輸 途徑還不清楚，而且非病毒載體的跨膜水平、內(nèi)化途徑以及內(nèi)涵體地逃離機(jī)制也不是很清 楚，同時，由于目前的大多數(shù)載體缺乏靶向基團(tuán)，對細(xì)胞的選擇性比較差且轉(zhuǎn)染效率低。因 此開發(fā)低毒高效具有熒光基團(tuán)和靶向基團(tuán)的非病毒基因載體具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 作為各種廣泛且細(xì)致的研究和實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在大環(huán)多 胺[12]aneN3類陽離子脂質(zhì)中同時引入靶向基團(tuán)膽酸和熒光基團(tuán)萘酰亞胺，之后形成的轉(zhuǎn) 基因載體不僅能夠在同一個細(xì)胞內(nèi)監(jiān)測載體/DNA復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)以及釋放，而且對 肝癌細(xì)胞具有一定的選擇性?；谶@種發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。
[0006] 本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu) 點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種具有多功能的大環(huán)多胺[12]aneN3陽離子脂質(zhì)的 轉(zhuǎn)基因載體，不僅能夠在同一個細(xì)胞內(nèi)監(jiān)測載體/DNA復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)以及釋放，而 且對肝癌細(xì)胞具有一定的選擇性，以促進(jìn)基因治療的發(fā)展。
[0008] 本發(fā)明還有一個目的是提供含有靶向基團(tuán)及熒光基團(tuán)的[12]aneN3類陽離子脂質(zhì) 的制備方法以及含有該陽離子脂質(zhì)的轉(zhuǎn)基因載體的制備方法。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種含有靶向基團(tuán)及熒光基 團(tuán)的[12]aneN3類陽離子脂質(zhì)，所述陽離子脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)式如下：
[0011]本發(fā)明的目的還可以進(jìn)一步由含有靶向基團(tuán)及熒光基團(tuán)的[12]aneN3類陽離子脂 質(zhì)的制備方法來實(shí)現(xiàn)，該方法的合成路線如下：
[0013] 所述方法具體步驟包括：
[0014] 步驟一、按比例稱取式3化合物、式2化合物、催化劑、縮合劑和有機(jī)堿，加入溶劑溶 解，在氮?dú)夥諊路磻?yīng)8~10小時，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，柱層析分離得到式4化合物；
[0015] 步驟二、所述步驟一得到的式4化合物與癸二胺在乙二醇單甲醚溶劑中回流，反應(yīng) 結(jié)束后，冷卻、過濾、洗滌與柱層析分離得到式5化合物；
[0016] 步驟三、將所述步驟二得到的式5化合物、催化劑、縮合劑、式6化合物與有機(jī)堿加 入無水N，N_二甲基甲酰胺溶劑，在氮?dú)夥諊路磻?yīng)8~10小時，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，柱層 析分離得到式7化合物；
[0017] 步驟四、將所述步驟三得到的式7化合物、式8化合物溶于四氫呋喃溶劑中得四氫 呋喃溶液，將溶有硫酸銅和維生素 C的水溶液加入所述四氫呋喃溶液中，室溫下反應(yīng)8~10 小時，反應(yīng)結(jié)束后，加入水，二氯甲烷萃取，柱層析分離得到式9化合物；
[0018] 步驟五、將所述步驟四得到的式9化合物加入到氯化氫的飽和乙酸乙酯溶液中，室 溫攪拌反應(yīng)，析出固體，然后將固體過濾，得到式1化合物陽離子脂質(zhì)。
[0019] 優(yōu)選的是，其中，在所述步驟一中，所述式2化合物和所述式3化合物的物質(zhì)的量的 比為1:1，所述催化劑為1-羥基苯并三唑，所述縮合劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰 二亞胺鹽酸，所述有機(jī)堿為N，N-二異丙基乙胺，柱層析分離中采用的洗脫劑為二氯甲烷和 甲醇，二氯甲烷和甲醇的體積比為20:1。
[0020] 優(yōu)選的是，其中，在所述步驟二中，所述式4化合物與所述癸二胺的摩爾比為1: 5.3,回流時間為20小時，所述柱層析分離中采用的洗脫劑為二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和 甲醇的體積比為10:1。
[0021] 優(yōu)選的是，其中，在所述步驟三中，所述催化劑為1-羥基苯并三唑，所述縮合劑為 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸，所述有機(jī)堿為N，N-二異丙基乙胺，柱層析分 離中采用的洗脫劑為二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和甲醇的體積比為10:1。
[0022]優(yōu)選的是，其中，在所述步驟四中，所述四氫呋喃溶液中的四氫呋喃和所述水溶液 中的水的體積比為2:1，柱層析分離中采用的洗脫劑為二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和甲醇的 體積比為10:1。
[0023] 為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，還提供了一種轉(zhuǎn)基因載體，所述轉(zhuǎn) 基因載體由含有靶向基團(tuán)及熒光基團(tuán)的[12]aneN 3類陽離子脂質(zhì)、二油酰磷脂酰乙醇胺和 高純滅菌緩沖液組成。
[0024] 優(yōu)選的是，其中，所述陽離子脂質(zhì)的摩爾濃度為l.OmM，所述陽離子脂質(zhì)與所述二 油酰磷脂酰乙醇胺的摩爾比為1: 2。
[0025] 本發(fā)明的目的還可以進(jìn)一步由轉(zhuǎn)基因載體的制備方法來實(shí)現(xiàn)，該方法具體包括步 驟:將所述陽離子脂質(zhì)、二油酰磷脂酰乙醇胺與無水氯仿加入到高溫滅菌的燒瓶中，溶解后 減壓濃縮得到脂質(zhì)體膜，將所述脂質(zhì)體膜真空干燥去除殘留氯仿，干燥后的脂質(zhì)體膜與預(yù) 先預(yù)熱到70°C的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液混合配成所需濃度的溶液，超聲得到所述 轉(zhuǎn)基因載體。
[0026]本發(fā)明的目的還可以進(jìn)一步由含有靶向基團(tuán)及熒光基團(tuán)的[12]aneN3類陽離子脂 質(zhì)在制備轉(zhuǎn)基因載體中的應(yīng)用來實(shí)現(xiàn)。
[0027]本發(fā)明至少包括以下有益效果：
[0028] 1、提供含有靶向基團(tuán)和熒光基團(tuán)的陽離子脂質(zhì)，因此能夠提高陽離子脂質(zhì)形成轉(zhuǎn) 基因載體的靶向性和監(jiān)測跟蹤性能；
[0029] 2、轉(zhuǎn)基因載體細(xì)胞毒性較低，對肝癌細(xì)胞具有一定的靶向性，可以在同一個細(xì)胞 內(nèi)檢測DNA的跨膜、轉(zhuǎn)運(yùn)以及釋放過程，同時具有較高的轉(zhuǎn)染效率；
[0030] 3、陽離子脂質(zhì)和轉(zhuǎn)基因載體的制備方法簡單、成熟、易于掌控；
[0031] 4、轉(zhuǎn)基因載體與Cy5標(biāo)記的DNA的復(fù)合物幾乎能夠百分之百的進(jìn)入到肝癌細(xì)胞 HepG2中，對肝癌細(xì)胞具有很好的選擇性；
[0032] 5、轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染效率均超過市售轉(zhuǎn)基因載體Lipofectamine2000,其中在細(xì)胞 U20S中的轉(zhuǎn)染效率為Lipof ectamine2000的4倍；
[0033] 6、轉(zhuǎn)基因載體能全部包裹DNA，可作為DNA跨膜、轉(zhuǎn)運(yùn)的良好載體；
[0034] 7、脂質(zhì)體與DNA凝聚后的粒徑。形成的凝聚試劑均可與DNA形成200-450nm大小的 顆粒，利用掃描電鏡技術(shù)，可以看到形成復(fù)合物的形狀為帶棱的多邊形，這為成功穿入細(xì)胞 膜實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染具有重要的意義；
[0035] 8、通過熒光檢測，可以清楚地監(jiān)測基因載體1與Cy5_DNA在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)以及釋放 過程。對于轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的研究具有非常重要的意義。
[0036] 本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本 發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
【附圖說明】
[0037] 圖1為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因載體與DNA復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；
[0038] 圖2為本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物在六549、此？62、此1^、1]203和 CCC-HPF-I細(xì)胞中的細(xì)胞毒性圖；
[0039] 圖3為本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物的粒徑形貌圖；
[0040] 圖4為本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體與Cy5標(biāo)記的DNA的復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸以及釋放 過程圖；
[0041] 圖5是本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體與Cy5標(biāo)記的DNA的復(fù)合物對不同細(xì)胞靶向性圖片以 及不同抑制條件對細(xì)胞吸收的抑制效果圖；
[0042] 圖6是本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因載體與pGL-3DNA復(fù)合物在A549、HepG2、HeLa、U20S和CCC-HPF-I細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0044] 應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如"具有"、"包含"以及"包括"術(shù)語并不配出一個或多 個其它元件或其組合的存在或添加。
[0045] 〈實(shí)例 1>
[0046] -種含有靶向基團(tuán)及熒光基團(tuán)的[12]aneN3類陽離子脂質(zhì)，所述陽離子脂質(zhì)的結(jié) 構(gòu)式如下：
[0048] 陽離子脂質(zhì)的方法，其合成路線如下：
[0049]
[0050]所述方法具體步驟包括：
[0051 ] 步驟一、按比例稱取式3化合物（1 · 28g，3 · 13mmol)、式2化合物（1 · Og，3 · 13mmol)、 1-羥基苯并三唑催化劑（I. 15g，0.57mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸 縮合劑（0.6(^，3.13111111〇1)與1'1，1'1-二異丙基乙胺（0.8(^，6.261]11]1〇1)，加入二甲基亞砜溶劑 40mL溶解，在氮?dú)夥諊路磻?yīng)8~10小時，反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸掉溶劑，加入35mL