一種殺菌化合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于化合物領(lǐng)域，具體涉及一種殺菌化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 芽孢桿菌是一類產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽性菌株，它的分布廣泛，生理特征豐富，易于 分離和培養(yǎng)，是自然界中重要的微生物菌群，芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，包括由 非核糖體途徑合成的非核糖體肽類抗生素以及由核糖體途徑合成的細(xì)菌素、酶類及其他活 性蛋白類抗菌物質(zhì)等。
[0003] 168菌株是芽孢桿菌的模式菌株，也是目前研究的最為透徹的菌株，他的全基因組 已于1997年測序完成。與野生芽孢桿菌不同的是模式菌株168由于在實(shí)驗(yàn)室的長期繼代培 養(yǎng)，發(fā)生了很多的自發(fā)突變因而喪失了很多野生型的特點(diǎn)，比如sfp基因的自發(fā)突變，使得 168菌株喪失了產(chǎn)生脂肽類化合物的能力，因而缺失了抑菌的能力。sfp基因編碼的4'-磷酸 泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶，是芽孢桿菌非核糖體途徑合成脂肽類化合物的關(guān)鍵基因。
[0004] 本研究的目標(biāo)菌株解淀粉芽孢桿菌HAB-2( 2015年1月27日在中國典型培養(yǎng)物保藏 中心進(jìn)行了菌種保藏，并證明存活，其保藏登記號為：CCTCC M 2015070,地址為武漢大學(xué) 內(nèi)）經(jīng)過一系列的前期實(shí)驗(yàn)表明：生防菌HAB-2具有廣譜的抑制熱帶病原真菌的活性，并且 對部分植物具有促進(jìn)生長，對鮮果具有保鮮的作用，但是該菌株沒有sfp基因，但是通過現(xiàn) 代的儀器分析手段我們又在HAB-2發(fā)酵液中檢測得到了由于sfp缺失而不可能得到的脂肽 類物質(zhì)一一表面活性素類物質(zhì)，因此研究該菌株的具體活性成分很有必要，值得進(jìn)一步的 研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，對解淀粉芽孢桿菌HAB-2的發(fā)酵液的 具體活性成分進(jìn)行研究，提供一種殺菌化合物，本發(fā)明還提供了含有改殺菌化合物的殺菌 劑，以及該殺菌化合物的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種殺菌化合物，所述殺菌化合物(下文中稱為化合 物H2)的結(jié)構(gòu)式如下式所示：
[0008] 優(yōu)選地，所述殺菌化合物分離自解淀粉芽孢桿菌HAB-2的發(fā)酵液中，所述菌株HAB-2的保藏編號為:CCTCC M 2015070。
[0009] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述解淀粉芽孢桿菌HAB-2的發(fā)酵液的采用下述步驟制備而成;將 解淀粉芽孢桿菌HAB-2接種于液體的溶菌肉湯培養(yǎng)基中，在26~30°C的條件下，50~500轉(zhuǎn)/ 分鐘搖菌1~3天，即得到發(fā)酵液。
[0010] 本發(fā)明第二個(gè)方面是提供一種殺菌劑，所述殺菌劑的活性成分包括本發(fā)明第一個(gè) 方面所述的任意一種殺菌化合物。
[0011] 本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的殺菌化合物的制備方法:所 述殺菌化合物從解淀粉芽孢桿菌HAB-2的發(fā)酵液中分離得到。
[0012] 優(yōu)選地，所述制備方法包括以下步驟：
[0013] 步驟1，取解淀粉芽孢桿菌HAB-2的發(fā)酵液，正丁醇萃取，取萃取液，濃縮；
[0014] 步驟2,對濃縮物采用柱層析分離得到所述殺菌化合物。
[0015] 進(jìn)一步優(yōu)選地，柱層析分離包括以下步驟：
[0016] (1)對濃縮物使用減壓柱層析（抽柱Vacuum Liquid Chromatography)，采用氯仿 和甲醇進(jìn)行梯度洗脫；
[0017] (2)取具有抑菌活性的餾分，采用常壓柱分離，洗脫所用溶劑為步驟（1)中洗脫出 具有抑菌活性的餾分的溶劑；
[0018] (3)取步驟(2)得到的餾分中具有抑菌活性的餾分，采用凝膠柱分離，洗脫所用溶 劑為步驟(1)中洗脫出具有抑菌活性的餾分的溶劑；
[0019] (4)取步驟(3)得到的餾分中具有抑菌活性的餾分，采用凝膠柱分離洗脫所用溶劑 為甲醇；
[0020] (5)取取步驟(4)得到的餾分中具有抑菌活性的餾分，過C18反向柱，采用甲醇和水 梯度洗脫，合并具有抑菌活性的部分，濃縮干燥，既得。
[0021] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，若步驟（1)得到的具有抑菌活性的餾分由不同比例的氯仿和甲 醇的混合溶劑洗脫出來的，則步驟(2)洗脫所用溶劑的極性小于或等于步驟(3)洗脫所用溶 液的極性。
[0022] 優(yōu)選地，所述解淀粉芽孢桿菌HAB-2的發(fā)酵液的采用下述步驟制備而成;將解淀粉 芽孢桿菌HAB-2接種于液體的溶菌肉湯培養(yǎng)基中，在26~30°C的條件下，50~500轉(zhuǎn)/分鐘搖 菌1~3天，即得到發(fā)酵液。
[0023] 本發(fā)明對解淀粉芽孢桿菌HAB-2的發(fā)酵液的具體活性成分進(jìn)行研究，分離得到化 合物H2，具有廣譜的抑制熱帶病原真菌的活性，并且對部分植物具有促進(jìn)生長，對鮮果具有 保鮮的作用，值得進(jìn)一步的研究。
【附圖說明】
[0024] 圖1為化合物H2的1H-1H C0SY、HMBC和NOSEY的關(guān)聯(lián)圖；
[0025] 圖2為減壓柱層析分離得到的各餾分的薄層層析色譜和抑菌效果圖，其中，圖a為 抑菌試驗(yàn)結(jié)果，圖b為薄層層析色譜，1為脂肽，2為甲醇沖柱餾分，3為C:M=1:1沖柱餾分(C 為氯仿，M為甲醇），4為C:M=2:1沖柱餾分，5為C:M=3:1沖柱餾分，6.為C:M = 5:1沖柱餾分7 為正丁醇提取物；
[0026] 圖3為過常壓柱得到的各餾分的薄層層析色譜和抑菌效果圖，其中，圖a抑菌試驗(yàn) 結(jié)果，圖b為薄層層析色譜；
[0027] 圖4為過C:M=1:1凝膠柱得到的各餾分的薄層層析色譜和抑菌效果圖，其中，圖a 和圖b為抑菌試驗(yàn)結(jié)果，圖c為薄層層析色譜；
[0028] 圖5為過甲醇凝膠柱得到的各餾分的抑菌效果圖；
[0029] 圖6過C18反向柱得到的各餾分的抑菌效果圖；
[0030] 圖7為提純的化合物H2的抑菌效果圖，其中，圖a為抑菌試驗(yàn)結(jié)果，1為正丁醇提取 物，2為過C18反向柱得到活性成分，3為提純的化合物H2;圖b為化合物H2的薄層層析色譜； [0031 ]圖8為化合物H2的氨基酸分析圖；
[0032] 圖9為化合物H2與咪鮮胺抑菌能力比較結(jié)果圖，其中，圖a為抑菌試驗(yàn)結(jié)果，1為咪 酰胺，2為脂肽提取物，3為正丁醇提取物，4為純品化合物H2,圖b為咪鮮胺與抑菌圈大小線 性回歸方程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面參照附圖，結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以更好地理解本發(fā) 明。
[0034] 1、化合物分離
[0035] 1.1解淀粉芽孢桿菌HAB-2的發(fā)酵液
[0036]將保存的生防菌菌株HAB-2接種于溶菌肉湯培養(yǎng)基上28°C活化培養(yǎng)，培養(yǎng)3天，挑 去黃豆粒大小的生防菌HAB-2加入到液體的溶菌肉湯培養(yǎng)基中，28°C，200轉(zhuǎn)每分鐘搖菌2 天，即得到發(fā)酵液，利用高速離心機(jī)，10000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘去除菌體，得到無菌體發(fā)酵 液，
[0037] I. 2正丁醇萃取法
[0038]按照體積比1:1的比例將發(fā)酵液與正丁醇充分混合，靜止12個(gè)小時(shí)，分液漏斗萃取 得到上層正丁醇，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，蒸出有機(jī)溶劑正丁醇即得到濃縮物。
[0039] 1.3減壓柱層析
[0040] 對濃縮物使用減壓柱層析，采用氯仿(C)和甲醇(M)進(jìn)行梯度洗脫:C:M = 5:1(V/V) 4C:M=3:1(V/V)-C:M = 2:1(V/V)4C:M=1:1(V/V)-M。通過硅膠 TLC 薄層層析來檢測餾 分和更換洗脫溶劑。
[0041] 將芒果炭疽病病原真菌接種于馬鈴薯葡糖糖瓊脂培養(yǎng)基上，將各餾分滴加滅菌濾 紙片上徹底干燥以后，均勻的貼在培養(yǎng)基上，檢測各餾分的抑菌活性。結(jié)果如圖2所