一種數(shù)字pcr芯片及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學與分子生物學技術應用領域，具體涉及一種分散微量核酸或細胞溶液的裝置及使用方法。
【背景技術】
[0002]在生物、化學檢測分析中，聚合酶鏈式反應(PCR，polymers chain react1n)技術是針對核酸的一種強有力的研究技術和手段。自1985年Kary Mul I is發(fā)明PCR方法以來，PCR儀便出現(xiàn)在世界各地大大小小的實驗室中，從第一代的常規(guī)半定量終點式PCR技術到第二代的實時定量PCR技術(Real-time PCR)，再發(fā)展到現(xiàn)在的第三代絕對定量化的數(shù)字PCR技術，PCR技術突飛猛進，朝著絕對定量化、高精確度、高通量以及易檢測性的方向發(fā)展。早期的絕對定量PCR是通過微流體芯片流路將核酸溶液分散成為成千上萬個納升級別的微液滴，并通過油包水的結(jié)構將每個液滴分離開來，然后通過熒光探針標記的核酸擴增，放大目標分子的信號，最終通過光電倍增管(PMT ,photomultiplier)進行逐個檢測。油包水技術路線存在一些難以避免的問題，譬如微液滴破裂造成的污染，微液滴發(fā)生器復雜的流路設計，逐一檢測的耗時性等。新一代的絕對定量數(shù)字PCR基于微孔芯片和高分辨率感光元件(CCD，Charge Coupled Device)成像技術，省去了復雜的芯片流路設計和漫長的檢測分析過程，保證了每一個微反應體系之間具有良好的隔離，PCR擴增反應的結(jié)果通過CCD拍攝一張熒光照片，就能夠進行快速分析，確定目標分子的有無和數(shù)量。
[0003]目前市場上的基于微孔PCR的芯片存在的問題就是加樣過程難以準確控制，需要專業(yè)的訓練和儀器的輔助才能達到理想的樣品分散效果。而且作為耗材的芯片本身和配套的檢測儀器的價格也十分昂貴。因此，發(fā)明成本低廉、使用簡單甚至無需培訓的絕對定量化數(shù)字PCR芯片具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種使用方便、可以自動分散核酸或細胞溶液的數(shù)字PCR芯片及其使用方法。
[0005]為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案:
[0006]該PCR芯片包括硅質(zhì)微孔芯片以及內(nèi)部具有流道的芯片殼體，所述硅質(zhì)微孔芯片表面疏水而硅質(zhì)微孔芯片的微孔內(nèi)壁親水，所述芯片殼體內(nèi)設置有與所述流道連通的空腔，所述芯片殼體的上側(cè)表面設置有與所述空腔連通的通氣孔以及與所述流道連通的加樣孔，硅質(zhì)微孔芯片固定于所述空腔內(nèi)靠近所述流道一側(cè)且位于所述流道下方，硅質(zhì)微孔芯片與所述空腔之間留有用于連通所述空腔位于硅質(zhì)微孔芯片上下兩側(cè)的空間的間隙，所述芯片殼體的下側(cè)表面設置有作為所述空腔下側(cè)壁面的導熱層，所述空腔的上側(cè)壁面與硅質(zhì)微孔芯片之間存在100?200μπι間隙，硅質(zhì)微孔芯片的微孔朝向所述空腔的上側(cè)壁面。
[0007]所述芯片殼體的上側(cè)表面設置有用于控制所述流道開閉的閥門(S卩PDMS薄膜截止閥)。
[0008]所述硅質(zhì)微孔芯片表面的尺寸為AXB，其中，A 2 10mm,B > 10mm，所述微孔的數(shù)量為20000個以上，單個微孔的容積為0.8?1.5nL。
[0009]所述PCR芯片具體包括依次層疊的第一PMMA板、第一雙面膠、第二 PMMA板、若干層中間雙面膠、第三PMMA板以及鋁質(zhì)導熱基座，硅質(zhì)微孔芯片位于第三PMMA板上的第三PMMA板鏤空窗口中，所述若干層中間雙面膠上具有與所述第三PMMA板鏤空窗口位置對應的中間雙面膠鏤空窗口，與第二PMMA板鄰接的一層中間雙面膠上設置有與中間雙面膠鏤空窗口連接的鏤空流道，硅質(zhì)微孔芯片部分邊緣與中間雙面膠鏤口窗口邊緣接觸，鋁質(zhì)導熱基座將第三PMMA板鏤空窗口蓋住，第一 PMMA板上設置有通氣孔、與所述鏤空流道相應位置點對應的加樣孔以及PDMS薄膜截止閥安裝孔，通氣孔位于第三PMMA板鏤空窗口覆蓋區(qū)域外，且位于鋁質(zhì)導熱基座覆蓋區(qū)域內(nèi)，第一雙面膠以及第二PMMA板上設置有與所述安裝孔以及加樣孔位置對應的連通孔，連通孔的尺寸小于第一 PMMA板上對應的孔結(jié)構的尺寸3?4mm，所述安裝孔中設置有PDMS薄片，第一雙面膠、第二 PMMA板、所述若干層中間雙面膠以及第三PMMA板上設置有與通氣孔位置對應的連通氣孔。
[0010]上述數(shù)字PCR芯片的使用方法，包括以下步驟:
[0011 ] I)將親水性樣品溶液注入加樣孔中，并利用外壓使所述樣品溶液沿所述流道流至硅質(zhì)微孔芯片，然后分散至所述微孔內(nèi)；
[0012]2)經(jīng)過步驟I)后，由加樣孔注入密封油，利用密封油填充所述空腔中硅質(zhì)微孔芯片之外的部分，同時排出所述空腔內(nèi)的空氣，形成以所述微孔為單位的多個互相獨立的密閉微反應體系。
[0013]所述外壓由注射器提供。
[0014]所述樣品溶液的一次注入總體積至少為15yL。
[0015]所述樣品溶液為核酸溶液或細胞溶液。
[0016]所述核酸溶液的濃度小于1333COpieSAiL;所述細胞溶液的濃度小于1.3X 16個/
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[0017]本發(fā)明的有益效果為:
[0018]本發(fā)明充分利用硅質(zhì)微孔芯片與芯片殼體的空隙所發(fā)揮的毛細作用，以及硅質(zhì)微孔芯片自身表面疏水內(nèi)部親水的特點，使親水性的核酸或細胞樣品溶液流過硅質(zhì)微孔芯片上方時，被鋪展、單分散、并保留在每一個微孔中，再通入密封油充滿硅質(zhì)微孔芯片之外的整個空間，實現(xiàn)對每個微反應體系的完全隔離。本發(fā)明所述的數(shù)字PCR芯片具有設計新穎，容易使用，成本低廉，適用范圍廣泛的優(yōu)點，與傳統(tǒng)的油包水單分散核酸樣品的方法相比成本降低了 10多倍，樣品準備時間短，操作方法簡單，同時分散核酸樣品的準確性、反應體系的可靠性極佳，交叉污染小，且便于操作，無需專業(yè)知識培訓。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明所述PCR芯片的結(jié)構示意圖；
[0020]圖2為本發(fā)明所述PCR芯片部件的多層組裝示意圖；
[0021 ]圖3為本發(fā)明所述鋁質(zhì)導熱基座的結(jié)構示意圖；其中，(a)為剖視圖，(b)為俯視圖；
[0022]圖4為本發(fā)明所述硅質(zhì)微孔芯片的掃描電鏡圖；其中，(a)為硅質(zhì)微孔芯片正面(100倍)，(b)為硅質(zhì)微孔芯片截面(200倍)；
[0023]圖5為本發(fā)明所述PCR芯片對于親水性色素溶液的擴散圖；其中，(a)為擴散前(100倍，圖中白色線段代表比例尺60μπι)，(b)為擴散后(100倍)；
[0024]圖6為本發(fā)明所述硅質(zhì)微孔芯片在加入了色素溶液后的液體邊界(200倍)；
[0025]圖7a為本發(fā)明所述PCR芯片對濃度為16個/mL的細胞溶液進行分散之后進行死活細胞熒光染色的活細胞熒光圖(100倍)；
[0026]圖7b為本發(fā)明所述PCR芯片對濃度為16個/mL的細胞溶液進行單細胞分散之后在明場顯微鏡下的觀察結(jié)果(40倍，放大圖:200倍)；
[0027]圖7c為本發(fā)明所述PCR芯片對濃度為16個/mL的細胞溶液進行單細胞分散之后在明場顯微鏡下的觀察結(jié)果(400倍)；
[0028]圖8a為本發(fā)明所述PCR芯片對濃度為16個/mL的細胞溶液進行單細胞分散之后的細胞DAPI熒光染色圖(100倍)；
[0029]圖8b為本發(fā)明所述PCR芯片對濃度為16個/mL的細胞溶液進行單細胞分散之后的細胞DAPI熒光染色圖(200倍)；
[0030]圖9為本發(fā)明所述PCR芯片對加入了Taqman熒光探針的核酸溶液在PCR反應后的熒光檢測結(jié)果(100倍，放大圖:200倍)；
[0031]圖10為本發(fā)明所述PCR芯片的親水性樣品的油封結(jié)果(100倍，放大圖:200倍)；
[0032]圖中:I為PMMA板，2為加樣孔，3為PDMS薄膜截止閥安裝孔，4為硅質(zhì)微孔芯片，5為通氣孔，6為鋁質(zhì)導熱基座，7為雙面膠，8為鏤空窗口，9為鏤空流道。
【具體實施方式】
[0033]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作詳細說明。
[0034]參見圖1、圖4(a)以及圖4(b)，本發(fā)明所述數(shù)字PCR芯片包括多層PMMA(polymethylmethacrylate，有機玻璃)板I (厚度為lmm)、加樣孔 2、PDMS(Polydimethylsi 1xane，聚二甲基硅氧烷)薄膜截止閥、硅質(zhì)微孔芯片4、通氣孔5和鋁質(zhì)導熱基座6。所述硅質(zhì)微孔芯片4包括厚約300μπι、面積為I平方厘米的矩形硅質(zhì)片材，采用光刻法在硅質(zhì)片材上加工約20，000個邊長為30μπι的正六邊形通孔(即微孔)，每個通孔的容積約為InL。通孔加工好后，硅質(zhì)片材首先經(jīng)過氧化，使所有表面(包括通孔內(nèi)壁表面)呈親水性，隨后拋光硅質(zhì)片材上表面和下表面，暴露出疏水的硅質(zhì)，形成具有上、下表面疏水、微孔內(nèi)壁親水的芯片結(jié)構。
[0035]所述PCR芯片還包括多層厚度約50μπι的3M雙面膠7，在制作PCR芯片時，雙面膠7既用于連接PMMA板I與硅質(zhì)微孔芯片4，又用于形成PMMA板I與硅質(zhì)微孔芯片4之間的空隙，還用于形成流道圖案。所述PCR芯片的檢測精確度(檢測極限)為:20,000個核酸分子(或細胞)中可檢測到一個目標核酸拷貝(或目標細胞)。
[0036]參見圖2，所述PCR芯片具體包括依次層疊的第一 PMMA板、第一雙面膠、第二 PMMA板、第二雙面膠、第三雙面膠、第三PMMA板以及鋁質(zhì)導熱基座6，單層PMMA板的圖案由臺式激光切割機加工而成，硅質(zhì)微孔芯片4位于第三PMMA板上的第三PMMA板鏤空窗口中，第三雙面膠以及第二雙面膠上具有與上述第三PMMA板鏤空窗口位置對應的第三雙面膠鏤空窗口以及第二雙面膠鏤空窗口，第二雙面膠上設置有與第二雙面膠鏤空窗口連接的鏤空流道9(流道圖案根據(jù)實驗需要設計)。硅質(zhì)微孔芯片4部分邊緣與第三雙面膠鏤口窗口邊緣接觸(靠近流道側(cè))，完成硅質(zhì)微孔芯片4固定，鋁質(zhì)導熱基座6將第三PMMA板鏤空窗口蓋住(鋁質(zhì)導熱基座6與第二PMMA板、第三PMMA板鏤空窗口、第二以及第三雙面膠鏤空窗口共同形成包圍硅質(zhì)微孔芯片4的空腔)，第一 PMMA板上設置有與鏤空流道相應位置點對應的加樣孔2以及PDMS薄膜截止閥安裝孔3，此外，第一PMMA板上還設置有通氣孔5，通氣孔5位于第三PMMA板鏤空窗口覆蓋區(qū)域外，同時，位于鋁質(zhì)導熱基座6覆蓋區(qū)域內(nèi)，第一雙面膠以及第二PMMA板上設置有與所述安裝孔以及加樣孔位置對應的連通孔，連通孔尺寸略小于第一 PMMA板上對應的孔結(jié)構的尺寸(例如加樣孔的直徑為5?8mm，比對應的連通孔的直徑