一種基于肥大細(xì)胞-巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片的構(gòu)建及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于肥大細(xì)胞-巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片的構(gòu)建及其應(yīng)用，屬于食品質(zhì)量分析檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]食物過敏原是指食物中能引起機(jī)體免疫反應(yīng)的抗原分子，水產(chǎn)品作為人類重要的食源性蛋白質(zhì)的主要來源，其中蝦、蟹等甲殼類水產(chǎn)品所引起的過敏癥在臨床反應(yīng)中最為常見。食品過敏癥是在全世界范圍內(nèi)廣泛流行的一類常見變態(tài)反應(yīng)性疾病，其具有癥狀種類繁多、病癥情況復(fù)雜、危害廣泛、難以徹底根治的特點(diǎn)，長期以來一直都是困擾醫(yī)學(xué)界的一大難題。近年來，在全世界范圍內(nèi)，隨著食品過敏癥的發(fā)病率不斷上升，對食物過敏的預(yù)防和檢測已經(jīng)成為一項(xiàng)迫切的需求，但由于目前尚無有效治療食物過敏癥的方法，而避免進(jìn)食含有致敏原的食物是唯一的預(yù)防手段，因此建立一種或多種靈敏檢測過敏原的分析方法顯得尤為重要。
[0003]現(xiàn)有檢測過敏病癥的方法主要分為以下兩大類:體內(nèi)檢測和體外檢測。雖然體內(nèi)檢測對醫(yī)生或是病人來說都是最方便可靠的方法，但是其潛在的風(fēng)險無法忽視，需要謹(jǐn)慎對待。在我國，對過敏原的體外檢測尚未得到大力重視，傳統(tǒng)的診斷模式依舊在使用，這不但不利于對過敏疾病的及時確診和治療，也會給病人帶來額外的身心痛苦。由于過敏原種類眾多，且因同個體而多變化，因此建立多種快速靈檢測過敏原的方法來取代體內(nèi)試驗(yàn)成為迫切需要。
[0004]細(xì)胞是形成有機(jī)體形態(tài)和功能的基本組成單位，對研究機(jī)體結(jié)構(gòu)和探索生命活動具有重要意義。細(xì)胞傳感技術(shù)以活細(xì)胞作為探測元件，通過對活細(xì)胞的基本生理性質(zhì)或細(xì)胞對被測物的響應(yīng)進(jìn)行檢測，從而定性定量地確定細(xì)胞的生理狀態(tài)或被檢物的含量。因此，細(xì)胞傳感技術(shù)對于研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能、探索生命的活動和規(guī)律、疾病的診斷和治療、藥物的設(shè)計(jì)和篩選、食品安全的監(jiān)督和檢測等都具有十分重大的意義。隨著生命工程技術(shù)的發(fā)展與信息技術(shù)的飛躍，各學(xué)科間的交叉融合，使得細(xì)胞傳感檢測研究得到了飛速發(fā)展，新型的納米材料、熒光及電化學(xué)細(xì)胞傳感器不斷問世，極大推動了生物傳感技術(shù)地迅猛發(fā)展。
[0005]近年來，微流控細(xì)胞芯片己被廣泛運(yùn)用于臨床檢測和疾病治療領(lǐng)域，通過在微型芯片上集成多種功能單元，可實(shí)現(xiàn)對被檢樣品的完整檢測，包括進(jìn)樣、反應(yīng)、分離、輸出等操作。早在1998年，Whitesides等就提出了采用軟光刻技術(shù)在聚二甲基硅氧烷(PDMS)基礎(chǔ)上制備微流控芯片的想法，并開發(fā)了多層微流通道實(shí)現(xiàn)了微流栗、閥等對微流體的良好控制。相比傳統(tǒng)的分析方法，微流控芯片具有樣品量需求量少，污染小，響應(yīng)時間短，分析效率高的特點(diǎn)。此外PDMS材料透明便于觀察，有利于精確控制實(shí)驗(yàn)過程，滿足批量化生產(chǎn)和高通量的需求。固定有細(xì)胞的微流控芯片能在細(xì)胞和分子水平上對細(xì)胞活動(如細(xì)胞增殖生長、固定迀移、內(nèi)吞外排、藥物作用)等進(jìn)行分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明建立了肥大細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系(二維細(xì)胞)的PDMS微流控芯片平臺，成功應(yīng)用于食品過敏原識別評價研究。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)肥了大細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系(二維細(xì)胞)的PDMS微流控芯片平臺。采用特殊流道設(shè)計(jì)，采用“張力閥道”實(shí)現(xiàn)了對兩種細(xì)胞的非直接接觸共培養(yǎng)，從而能夠精確控制兩種細(xì)胞共培養(yǎng)過程，從而有效的研究細(xì)胞旁分泌機(jī)制，以及通過在PDMS基底表面電鍍金電極，借助電化學(xué)阻抗信號對共培養(yǎng)中細(xì)胞的生理活動實(shí)時監(jiān)測。通過以上設(shè)計(jì)，構(gòu)建了用于食品過敏原識別評價研究的細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片平臺。
[0007]本發(fā)明的第一個目的是提供一種PDMS微流控芯片，所述TOMS微流控芯片的主要結(jié)構(gòu)一 PDMS流道層，由兩條平行等長的主通道構(gòu)成，通道兩端設(shè)有插槽以便注入液體;兩條主通道通過一條毛細(xì)管道垂直聯(lián)通。
[0008]所述PDMS微流控芯片是將電化學(xué)技術(shù)與微流控芯片相結(jié)合設(shè)計(jì)得到的，由PDMS流道層和鍍金硅片層這兩部分組成;所述毛細(xì)管道的兩端設(shè)計(jì)有插孔，用于插入微型參比電極;每一條主通道底面電鍍一枚金電極;所述I3DMS微流控芯片還包括鍵合在PDMS流道層下的鍍金硅片層，鍍金硅片層表面電鍍四組金電極(如圖2)，每個工作電極的引導(dǎo)線將工作電極和芯片邊緣的金手指(供電極夾固定)相連接，在工作電極的前方是半圈電鍍金層作為對電極，其也由電鍍導(dǎo)線連接到芯片邊緣的金手指上;所述微流控芯片的TOMS流道層與鍍金硅片層鍵合在一起構(gòu)成完整芯片。
[0009]所述?015流道層全長44670.83口111、寬3120(^111、厚4111111，由2條寬100(^111，長31673.16μπι的平行主通道構(gòu)成;每條主通道的兩端是直徑為2500μπι的插槽，通過該插槽細(xì)胞懸液、培養(yǎng)液、以及致敏藥物能夠由此注入兩條主流道中；兩條主通道中間是有一條直徑為ΙΟΟμπι、長ΙΟΟΟΟμπι的張力閥道，即毛細(xì)管道。
[0010]所述PDMS微流控芯片是將電化學(xué)技術(shù)與微流控芯片相結(jié)合設(shè)計(jì)得到的；在毛細(xì)管道兩端設(shè)計(jì)出直徑為2000μπι的插孔，用于插入微型Ag/AgCl參比電極;每一條主通道底面電鍍一枚金電極;在PDMS流道層下鍵合有鍍金硅片層，鍍金硅片層電鍍四組金電極，每個工作電極的直徑為ΙΟΟΟμπι，直徑為500μπι引導(dǎo)線將工作電極和芯片邊緣寬為4000μπι的金手指相連接，在工作電極的前方是半圈寬為100ym的電鍍金層作為對電極，對電極也由寬500μπι的電鍍導(dǎo)線連接到芯片邊緣的金手指上;將PDMS流道層與鍍金硅片層鍵合在一起構(gòu)成完整得到PDMS微流控芯片。
[0011 ]所述PDMS微流控芯片中，當(dāng)兩條主通道內(nèi)同時同向等速流動細(xì)胞懸液或者培養(yǎng)液時，毛細(xì)管道的兩端因?yàn)閴毫ο嗤蛊叫械膬蓷l主通道連通;而當(dāng)平行主通道的其中一個主通道停止栗入流體，則另一個主通道內(nèi)的液體就會通過毛細(xì)管道流入該通道內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)兩平行主通道的聯(lián)通。即當(dāng)壓力相同時，兩條主通道自己連通;而壓力不同時，一條主通道的液體通過壓力差流過毛細(xì)管通道流入另一個通道。
[0012]本發(fā)明的第二個目的是提供一種細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，是利用所述PDMS微流控芯片進(jìn)行共培養(yǎng)。
[0013]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述細(xì)胞共培養(yǎng)，是指共培養(yǎng)肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
[0014]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述細(xì)胞共培養(yǎng)，是將RBL-2H3肥大細(xì)胞和ANA-1巨噬細(xì)胞先在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2-3天，使細(xì)胞處于對數(shù)生長期，然后再用于芯片上培養(yǎng)。
[0015]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述芯片上的培養(yǎng)，是使用注射器分別吸取肥大細(xì)胞懸液和巨噬細(xì)胞懸液、拍氣泡，然后定速控制(速度一般控制在200yL/h?0.lmL/h)，使兩個注射器中的細(xì)胞懸液以相同流速注入芯片中，當(dāng)芯片兩條通道內(nèi)注滿兩種細(xì)胞懸液后，同時停止兩臺注射栗的運(yùn)作，將芯片放入CO2培養(yǎng)箱中孵育6小時(保證細(xì)胞的貼壁，防止培養(yǎng)基的流動沖刷對細(xì)胞生長的影響)，然后將注射器更換為不含細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)液(用于肥大細(xì)胞的為DMEM、巨噬細(xì)胞的為RPM1-1640)，再使注射器中培養(yǎng)液同時啟動兩臺注射栗持續(xù)栗入(端口不封閉)，以相同流速繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。
[0016]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述芯片上的培養(yǎng)，當(dāng)需要研究巨噬細(xì)胞與肥大細(xì)胞的相互作用時，在培養(yǎng)箱中孵育后，只啟動兩臺栗中的一臺(另一端封閉)，即研究巨噬細(xì)胞對肥大細(xì)胞影響時只啟動巨噬細(xì)胞一端的栗，反之則只啟動肥大細(xì)胞一端的栗，從而使一條流道內(nèi)的細(xì)胞代謝物隨著液體通過張力閥流入另一條細(xì)胞流道內(nèi)，達(dá)到共培養(yǎng)的目的。
[0017]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述PDMS微流控芯片進(jìn)行共培養(yǎng)，指經(jīng)高壓滅菌和紫外照射后的微流控芯片，用5ml注射器吸取細(xì)胞懸液后并架設(shè)在XSPOl注射栗上，采用安裝在筆記本上的操作程序控制栗的運(yùn)作，調(diào)節(jié)栗的流速將細(xì)胞懸液注入到微通道中；待注射栗將細(xì)胞懸液把細(xì)胞芯片的流道充滿時，停止栗的流速，將芯片放置于CO2培養(yǎng)箱中孵育6小時，保證細(xì)胞的貼壁，防止培養(yǎng)基的流動沖刷對細(xì)胞生長的影響。待細(xì)胞完全貼壁之后，將內(nèi)裝不含細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)液的注射器栗連接芯片一端的進(jìn)口，并使用電腦軟件調(diào)節(jié)一定的流速，向芯片內(nèi)連續(xù)不斷的供給培養(yǎng)液，從而達(dá)到連續(xù)培養(yǎng)的目的。
[0018]本發(fā)明的第三個目的是提供所述PDMS微流控芯片在食品過敏原檢測方面的應(yīng)用。
[0019]所述應(yīng)用，是在PDMS微流控芯片中的巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞共培養(yǎng)體系、巨