一種液態(tài)光合細菌高活力保存方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物制劑技術領域，具體設及一種長期保存液態(tài)光合細菌高活力的 方法。
【背景技術】
[0002] 光合細菌(Photosynthetic Bacteria,簡稱PSB)是地球上出現(xiàn)最早、具有原始光 能合成體系的原核生物，廣泛分布于海洋、湖泊、江河、水田、污泥及±壤中，是一大類能利 用有機小分子如氨氮、有機酸等作為生長因子進行不產氧光合作用的細菌，它在分類上屬 于細菌口，真細菌綱，紅螺菌目，根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第九版)可分為6個類群，27個 屬。6個類群即為著色菌科、外硫紅螺菌科、紫色非硫細菌、綠硫細菌、多細胞綠絲菌、鹽桿 困。
[0003] 光合細菌的研究始于日本，已有五十多年歷史，1965年，日本科學家發(fā)現(xiàn)光合細菌 可W治療媛魚貧血病，隨后推廣到海水養(yǎng)殖和淡水養(yǎng)殖中，均取得很大成功。近幾十年來， 經過全球科學家的進一步研究，發(fā)現(xiàn)光合細菌對魚、郵、蟹、貝和雞、鴨、豬、牛等養(yǎng)殖具有明 顯的提高存活率和促進生長的作用，同時在有機廢水處理方面也十分有效。由于光合細菌 菌體具有無毒無害并且營養(yǎng)豐富的特點，因而也被美國、日本等國用作保健食品的生產，效 果良好。
[0004] 我國自上世紀八十年代開始對光合細菌進行研究，在菌種分離、廢水處理、水產畜 牧、農業(yè)種植、清潔能源、保健食品等方面取得了許多重要成果，光合細菌的應用已深入到 農業(yè)、環(huán)保、能源乃至食品等各個方面。
[0005] 目前，光合細菌菌劑主要為液態(tài)產品，液態(tài)光合細菌最主要的問題是活力不易保 存，如要保持活力，通常每隔15天左右需要活化一次，否則活力就要呈數(shù)量級下降，因此，農 業(yè)部行業(yè)標準NY 527-2002《光合細菌菌劑》中雖然規(guī)定了光合細菌菌劑的有效期不得低于 6個月，同時又注明"有效期僅在監(jiān)督部口或仲裁雙方認為有必要時才檢驗"，說明6個月的 保存期都是一大難題。
[0006] 光合細菌的保種方法研究目前僅限于菌種的保存，如半固體法，冷凍干燥法等，不 適合光合細菌菌劑產品。
[0007] 為推廣應用光合細菌，專家學者們研究了多種固定化技術，如"光合細菌的固定化 方法"（公開號CN1810966A)，"一種固態(tài)狀光合細菌的制備方法"（公開號CN104293765A)， "固態(tài)光合細菌技術"（公開號CN1124293)等，但上述技術主要是為了解決運輸問題，實際 操作中不但增加了生產流程和生產成本，而且有的活力損失還很大，不適宜于大規(guī)模生產， 另外，固定化過程中排出的發(fā)酵清液，還容易造成二次污染，運也是目前市場上仍W液態(tài)光 合細菌為主體的重要原因。

【發(fā)明內容】

[000引針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種液態(tài)光合細菌的高活力保存方法，該方 法操作簡便，能夠長期有效保存液態(tài)光合細菌的活力，保存6個月后有效活菌數(shù)達90%W上， 保存12個月后有效活菌數(shù)達80%W上，且使用時無需再活化，可即時發(fā)揮功效，廣泛應用于 水產畜禽養(yǎng)殖領域。
[0009] 具體的，本發(fā)明是通過W下技術方案實現(xiàn)的： 一種液態(tài)光合細菌高活力保存方法，過程包括:在待保存的液態(tài)光合細菌中添加膠原 蛋白，密封保存，即可。
[0010] 本發(fā)明方法利用了光合細菌具有微弱胞外蛋白酶活力的特點，從膠原蛋白作為能 源緩釋底物，從而可W長久保存光合細菌的活力。
[0011] 作為本發(fā)明方法的進一步說明，在密封保存前，采用憐酸緩沖液調節(jié)液態(tài)光合細 菌的抑值至6.8~7.5。
[0012] 憐酸緩沖液即憐酸鹽緩沖液，簡稱PB或PB緩沖液，是生物化學研究中使用最為廣 泛的一種緩沖液，通常使用的有憐酸鋼緩沖液(化此P〇4&Na抽P〇4)和憐酸鐘緩沖液(K2HP化& K此P〇4)，由于它們有二級解離，緩沖的抑值范圍很廣。在本發(fā)明中，憐酸緩沖液可有效穩(wěn)定 液態(tài)光合細菌的pH值，光合細菌在穩(wěn)定的pH值條件下可充分利用其蛋白酶緩慢分解膠原蛋 白為小分子膚和氨基酸等物質，W維持其生命力與生物活性。
[0013] 作為本發(fā)明方法的進一步說明，所述膠原蛋白的添加量為液態(tài)光合細菌重量的 0.05 ~0.5〇/〇。
[0014] 作為本發(fā)明方法的進一步說明，所述膠原蛋白未經過酶解，分子量在250~350kDa 之間。
[0015] 作為本發(fā)明方法的進一步說明，所述光合細菌選自沼澤紅假單胞菌 (Rhodopseudomonas palustris)、芙膜紅假單胞菌伽odopseudomonas capsulatus)、球形 紅假單胞菌（I^hodopseudomonas sphaeroides)。
[0016] 光合細菌（Photosynthetic Bacteria,簡稱PSB)是地球上出現(xiàn)最早、自然界中普 遍存在、具有原始光能合成體系的原核生物，是在厭氧條件下進行不放氧光合作用的細菌 的總稱，是一類沒有形成芽抱能力的革蘭氏陰性菌，是一類W光作為能源、能在厭氧光照或 好氧黑暗條件下利用自然界中的有機物、硫化物、氨等作為供氨體兼碳源進行光合作用的 微生物。光合細菌廣泛分布于自然界的±壤、水田、沼澤、湖泊、江海等處，主要分布于水生 環(huán)境中光線能透射到的缺氧區(qū)。在水產養(yǎng)殖中，能夠降解水體中的亞硝酸鹽、硫化物等有毒 物質，實現(xiàn)充當巧料、凈化水質、預防疾病、作為飼料添加劑等功能。光合細菌適應性強，能 忍耐高濃度的有機廢水，對酪、氯等毒物有一定有忍受和分解能力，具有較強的分解轉化能 力。它的諸多特性，使其在無公害水產養(yǎng)殖中具有巨大的應用價值。
[0017] 作為本發(fā)明方法的進一步說明，所述保存是在溫度為35°CW下、光照強度為100~ lOOOLx的條件下靜置保存。
[0018] 作為本發(fā)明方法的進一步說明，所述液態(tài)光合細菌是將光合細菌經活化、種子培 養(yǎng)、擴大培養(yǎng)后制備而得的。
[0019] 作為本發(fā)明方法的進一步說明，所述活化是指將光合細菌接種于ATYP瓊脂培養(yǎng)基 上，在溫度為28~32°C、光照強度為3000~5000LX的條件下培養(yǎng)4~5d。
[0020] 作為本發(fā)明方法的進一步說明，所述種子培養(yǎng)是指將經活化的光合細菌接種于種 子培養(yǎng)液中，在溫度為25~30°C、光照強度為2000~5000LX的條件下培養(yǎng)2~3d;所述種子 培養(yǎng)液由包括W下重量份數(shù)比的組分：乙酸鋼2~4份、碳酸氨鋼0.5~1.5份、氯化錠0.5~ 1.5份、憐酸氨二鐘0.4~0.6份、氯化儀0.15~0.25份、氯化亞鐵-EDTA0.004~0.006份、氯 化鋼4~6份、水900~1100份，經調節(jié)pH值為7.2~7.6，蒸汽滅菌，即得。
[0021 ]作為本發(fā)明方法的進一步說明，所述擴大培養(yǎng)是指將經種子培養(yǎng)的光合細菌接種 于擴大培養(yǎng)液中，在溫度為25~30°C、光照強度為2000~5000LX的條件下培養(yǎng)5~lOd;所述 擴大培養(yǎng)液由包括W下重量份數(shù)比的組分：乙酸鋼2~4份、碳酸氨鋼0.5~1.5份、氯化錠 0.5~1.5份、憐酸氨二鐘0.4~0.6份、氯化儀0.15~0.25份、氯化亞鐵-EDTA0.004~0.006 份、氯化鋼4~6份、水900~1100份，經調節(jié)抑值為7.2~7.6,蒸汽滅菌，即得。
[0022] 本發(fā)明所用到的光合細菌菌種(可購自于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、、廣東省微生 物研究所菌種保藏管理中屯、、中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、、中國普通微生物菌種保 藏管理中屯、、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、和菌種制備企業(yè)等）和其它原料均可從市 場上購買得到，其規(guī)格符合國家行業(yè)標準。
[0023] 相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明方法具有如下有益效果： (1) 本發(fā)明方法操作簡便，容易實施，保存條件要求簡單，放置于室內自然條件下保存 即可，并且能夠長期有效保存液態(tài)光合細菌的活力，保存6個月后有效活菌數(shù)達90%W上，保 存12個月后有效活菌數(shù)達80%W上； (2) 本發(fā)明方法所用膠原蛋白無需酶解，且用量少，因此保存成本低，但活力保存效果 佳，值得大力推廣； (3) 通過本發(fā)明方法保存的液體光合細菌在施用時無需進行活化，可即時發(fā)揮功效，廣 泛應用于水產畜禽養(yǎng)殖領域； (4) 通過實施本發(fā)明方法，可將菌體連同發(fā)酵液一并保存，一并施用，排除了二次污染 的風險，對環(huán)境效益好。
【具體實施方式】
[0024] W下結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，本實施例僅是對本發(fā)明作更清楚的 說明，而不是對本發(fā)明的限制。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā) 明構思的前提下，還可W做出若干變形和改進，運些均落在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0025] W下實施例所用到的光合細菌菌種和其它原料均從市場購買，其規(guī)格符合國家行 業(yè)標準。
[0026] -、液態(tài)光合細菌的制備 實施例1 液態(tài)光合細菌的制備，包括如下步驟： (1) 種子培養(yǎng)液的配制:稱取W下重量份數(shù)比的組分:乙酸鋼3份、碳酸氨鋼1份、氯化錠 1份、憐酸氨二鐘0.5份、氯化儀0.2份、氯化亞鐵-EDTA 0.005份、氯化鋼5份、蒸饋水1000份， 混勻，調節(jié)抑值為7.4±0.2，于12rC蒸汽滅菌15min，冷卻至30°C，備用； (2) 擴大培養(yǎng)液的配制:稱取W下重量份數(shù)比的組分:乙酸鋼4份、碳酸氨鋼1.5份、氯化 錠1.5份、憐酸氨二鐘0.6份、氯化儀0.25份、氯化亞鐵-EDTA 0.006份、氯化鋼6份、生活飲用 水1100份，混勻，調節(jié)pH值為7.4 ± 0.2，于121°C蒸汽滅菌15min，冷卻至30°C，備用； (3) 菌種活化:取沼澤紅假單胞菌(化odopseudomonas palustris)活菌作為發(fā)酵菌種， 用無菌吸管吸取ο. 5mL菌體懸浮液劃線接種于ΑΤΥΡ瓊脂培養(yǎng)基上，在溫度為28~32°C、光照 強度為3000~5000LX的條件下培養(yǎng)4d; (4)種子培養(yǎng):用金屬接種環(huán)取1~2環(huán)經活化的光合細菌接種于1L種子培養(yǎng)液中