2)放入生長培 養(yǎng)基中共培養(yǎng)，從而殺死或抵制絕大多細胞的繁殖，選出有大量產生該代謝物的抗反饋突 變株。將菌液稀釋合適濃度后取0.1ml在4.0A的抗板上涂布，37°C培養(yǎng)5-6天，挑取100個突 變株在正常斜面上擴增，經過搖瓶發(fā)酵篩選，獲得1株正突變株KN-1625菌株，該菌株產井岡 霉素4的含量比1^-162菌株高18%，產井岡霉素8的含量比1^-162菌株低約37.56%。
[001引4.菌株的鑒定
[0019] 該菌株出發(fā)菌株為黃麻鏈霉菌，革蘭氏陽性菌，通過復合誘變后，該菌株形態(tài)抱子 絲螺旋形，抱子卵圓形，表面光滑，菌落為鼠灰色，色素透入培養(yǎng)基內，基絲為深褐色，氣絲 鼠灰色。形態(tài)與出發(fā)菌株相同，未出現菌屬的改變，菌株鑒定仍為黃麻鏈霉菌。
[0020] 5.菌株的遺傳穩(wěn)定性
[0021] 將改良菌種KN-1625接斜面進行傳代實驗，W檢驗改良菌株的遺傳穩(wěn)定性，經傳4 代驗證實驗顯示該菌株穩(wěn)定性良好。
[0022] 表1 KN-1625菌株的傳代穩(wěn)定性考核
[0023]
[0024] 數據顯示，KN-1625菌株傳至四代產井岡霉素水平與第一代相當，證明該菌株遺傳 穩(wěn)定，可作為工程菌投入生產。
[0025] 實施例2利用菌株生產井岡霉素的試驗研究
[0026] 1)菌株活化
[0027] 將保藏的KN-1625菌株在高氏一號斜面培養(yǎng)基上活化，28°C培養(yǎng)7天，用無菌水將 菌苔洗下，得到種子菌懸液；
[002引2)二級種子培養(yǎng)
[0029] 將步驟1)所得種子菌懸液接入種子發(fā)酵罐，200rpm，40°C培養(yǎng)16-1化r，種子發(fā)酵 培養(yǎng)基成分為:大米粉4.66%，玉米粉2.52%，豆巧1.033%，化C1 0.03%，CaC03 0.05%， KH2P04 0.03%，余量為水，各成分的含量均按質量體積比；
[0030] 3)發(fā)酵培養(yǎng)
[0031] 將步驟2)發(fā)酵后得到的種子發(fā)酵液移入大罐發(fā)酵罐中培養(yǎng)，設置發(fā)酵參數為:通 氣比1:1，攬拌速度42化pm，發(fā)酵溫度40°C，培養(yǎng)時間30-3化r，放罐后得到含有井岡霉素的 發(fā)酵液，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：大米粉6.5 %，淀粉4 %，玉米粉2.5 %，豆巧2.5 %，NaCl 0.03 %，CaC03 0.03 %，KH2P04 0.03 %，消泡劑0.01 %，余量為水，所述消泡劑為XP-100F 系列發(fā)酵用有機娃消泡劑，各成分的含量均按質量體積比。
[0032] 4)放罐有效含量及雜質含量的HPLC檢測
[0033] HPLC檢測條件
[0034] 流動相:0.05mol/L憐酸氨二鋼-憐酸(PH7.0)甲醇=97:3
[0035] 色譜柱：TC-C18/5.8 200X4.6mm
[0036] 檢測器：紫外210nm
[0037] 流速：l.〇ml.min-l [003引保留時間：約5.0min
[0039] 將井岡霉素 A標準品配成的25、50、75、100、12511旨/1111五種不同含量的標準溶液，在 確定色譜條件下檢，W井岡霉素 A量為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制工作曲線，得到一條線 性關系良好的直線，線性回歸方程Υ = 7.6196Χ+36.675,相當系數R2 = 0.9995。說明井岡霉 素 A濃度在25~125ug/ml范圍時，峰面積與井岡霉素 A濃渡之間有良好的線性關系。
[0040] 5)數據分析
[0041] 在色譜工作站調出巧中濃度的標樣圖譜，進行較準、繪制標準曲線。
[0042] 根據井岡霉素 A、B的峰面積計算B/A的含量比，同時根據對照和標準曲線計算井岡 霉素 A的含量，檢測兩批次生產的數據，同時W出發(fā)菌株為對照，結果見下表。
[0043] 表2 KN-1625菌株與對照菌株的液相峰面積及數據統計
[0044]
[0045] 由表2數據顯示，CK菌株生產的發(fā)酵液中井岡霉素 A含量平均為2.085%，B/A平均 為18.45%;腳-1625菌株生產的發(fā)酵液中井岡霉素4含量平均為3.065,8八平均為 11.52% ;KN-1625菌株的井岡霉素 A含量比CK菌株提高了47.00%，B/A降低了37.56%。
[0046] KN-1625菌株生產的井岡霉素產量穩(wěn)定在300(K)yg/mLW上，比CK菌株也有所提高。
【主權項】
1. 一株產井岡霉素的黃麻鏈霉菌（Streptomyces corchorusii )KN_1625，保藏在中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M 2015710。2. 權利要求1所述的黃麻鏈霉菌KN-1625在井閃霉素生產中的應用。3. -種井閃霉素生產方法，其特征在于：以權利要求1所述的黃麻鏈霉菌KN-1625為發(fā) 酵菌株。4. 如權利要求3所述的井閃霉素生產方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 菌株活化:將所述黃麻鏈霉菌KN-1625菌株在高氏一號斜面培養(yǎng)基上活化，28°C培養(yǎng) 7天，用無菌水將菌苔洗下，得到種子菌懸液； 2) 二級種子培養(yǎng):將種子菌懸液接入種子發(fā)酵罐，200rpm，40°C培養(yǎng)16~18hr，種子發(fā) 酵培養(yǎng)基成分為：大米粉4.66%，玉米粉2.52%，豆柏1.033%，如(：10.03%，〇3(：〇3 0.05%，KH2P〇4 0.03%，余量為水，各成分的含量均按質量體積比； 3) 發(fā)酵培養(yǎng):將步驟2)發(fā)酵后得到的種子發(fā)酵液移入大罐發(fā)酵罐中培養(yǎng)，設置發(fā)酵參 數為:通氣比1:1，攪拌速度420rpm，發(fā)酵溫度40°C，培養(yǎng)時間30~32hr，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分 為：大米粉6.5%，淀粉4%，玉米粉2.5%，豆柏2.5%，NaCl 0.03%，CaC03 0.03%，KH2P〇4 0.03 %，消泡劑0.01 %，余量為水，各成分的含量均按質量體積比，發(fā)酵結束后得到含有井 岡霉素的發(fā)酵液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株產井岡霉素的黃麻鏈霉菌(Streptomyces？corchorusii)KN-1625，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC？NO:M2015710。該菌能提高井岡霉素發(fā)酵液中井岡霉素A的含量，降低井岡霉素B的含量，與出發(fā)菌株相比，井岡霉素A含量提高了47％，B/A降低了37.56％。且井岡霉素產量穩(wěn)定在30000μg/mL以上，KN-1625菌株的遺傳穩(wěn)定性好，傳至四代產井岡霉素水平與第一代相當。CCTCC NO：M 201571020151126
【IPC分類】C12R1/465, C12P19/46, C12N1/20
【公開號】CN105543125
【申請?zhí)枴緾N201510963611
【發(fā)明人】夏建榮, 程治國, 王夢婕, 周莉, 鄒維, 龔永華, 萬俊, 金海燕
【申請人】武漢科諾生物科技股份有限公司
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月21日