一種適用于表達crybb2抗原蛋白的大腸桿菌的培養(yǎng)基及發(fā)酵方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于表達crybb2抗原蛋白的大腸桿菌的培養(yǎng)基及發(fā)酵方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]先天性白內(nèi)障又稱嬰幼兒白內(nèi)障，是兒童致盲的主要原因之一，具有遺傳異質(zhì)性。先天性白內(nèi)障的發(fā)病機制還不十分明確。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，越來越多的與白內(nèi)障相關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)，至今為止已克隆了至少39個致病基因，主要分為4類:晶狀體蛋白基因、縫隙鏈接蛋白基因、膜蛋白基因及晶狀體發(fā)育過程中的各種調(diào)節(jié)蛋白因子。目前研究者認(rèn)為，晶狀體蛋白基因突變是引起遺傳性白內(nèi)障的主要原因。晶狀體蛋白，作為哺乳動物晶狀體中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，最大的特征在于其高度的穩(wěn)定性和可溶性。晶狀體蛋白可分為為α、β和γ晶狀體蛋白家族，是白內(nèi)障重要的候選致病基因。crybb2基因編碼即2-晶狀體蛋白，屬于β/γ晶狀體蛋白超家族成員，是晶狀體蛋白家族中表達最多的蛋白，具有較強的抗氧化及抗脫酰胺能力，其功能受到細(xì)胞生理和遺傳特性的調(diào)節(jié)。
[0003]—般情況下，蛋白的表達量與大腸桿菌發(fā)酵密度密切相關(guān)，大腸桿菌的收率直接關(guān)系到目的蛋白的得率。
[0004]crybb2基因編碼卵2_晶狀體蛋白作為該供試菌株表達的異源蛋白未能分泌至胞夕卜，而是以分泌物的形式存在于菌體胞內(nèi)，因此，為提高重組蛋白得率、降低培養(yǎng)體積、提升下游操作效率以及減少設(shè)備投入，本發(fā)明通過應(yīng)用高密度發(fā)酵技術(shù)，對供試的重組大腸桿菌菌株BL2 IDE (3) /pET28a-crybb2進行大規(guī)模培養(yǎng)，著重研究其發(fā)酵過程中菌體生長、基質(zhì)消耗、次級代謝產(chǎn)物乙酸的生成、動態(tài)平衡及其內(nèi)在規(guī)律等，確定控制發(fā)酵代謝的抑制性因素和限制性因素，實現(xiàn)對其發(fā)酵代謝過程的調(diào)節(jié)和控制，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分、發(fā)酵培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝，并進行中試放大及產(chǎn)業(yè)化放大研究，實現(xiàn)該供試菌株的高密度高表達發(fā)酵培養(yǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種適用于表達crybb2抗原蛋白的大腸桿菌的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基為全合成培養(yǎng)基，不僅營養(yǎng)成分含量準(zhǔn)確，可重復(fù)性強，能夠降低大規(guī)模發(fā)酵及后處理的操作難度，而且大大減少了大規(guī)模生產(chǎn)的成本。最關(guān)鍵的是本發(fā)明的培養(yǎng)基配方是適合于生產(chǎn)crybb2抗原蛋白的專用培養(yǎng)基，無論菌體量還是蛋白表達量都能得到顯著提高。
[0006]本發(fā)明還提供了一種一種適用于表達crybb2抗原蛋白的大腸桿菌的發(fā)酵方法，方法簡單，易行。
[0007]本發(fā)明最后一個目的在于提供了一種適用于表達crybb2抗原蛋白的大腸桿菌的培養(yǎng)基的應(yīng)用，包括利用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基進行重組大腸桿菌的工業(yè)發(fā)酵。
[0008]為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0009]—種適用于表達crybb2抗原蛋白的大腸桿菌的培養(yǎng)基，包括:胰蛋白胨1?25g/L，玉米漿I?20g/L，KH2P04 I?5g/L，K2HP04 I?5g/L，酵母浸膏 10?25g/L，(NH4)2S04 0.1?1.5g/L，MgS04.7H20 0.1?1.0g/L，NaCl I?15g/L，甘油I?15ml/L，余量是水，pH值為6.0?8.00
[0010]以上所述的培養(yǎng)基配方，優(yōu)選的:胰蛋白胨10?20g/L，玉米漿5?10g/L，KH2P04I~3g/L,K2HPO4 2?5g/L，酵母浸膏 15?25g/L，(NH4)2S04 0.5?I.5g/L，MgS04.7H20 0.1 —0.8g/L，NaCl 5?158/1，甘油5?12!111/1，余量是水，？!1值為6.0?7.5。
[0011]以上所述的培養(yǎng)基配方，優(yōu)選的:胰蛋白胨13g/L，玉米漿6g/L，KH2P041.6g/L，K2HPO4 2.2g/L，酵母浸膏 18g/L，(NH4)2S04 1.0g/L,MgS04.7H20 0.3g/L，NaCl 7g/L，甘油10ml/L，余量是水，pH值為7.0。
[0012]—種表達crybb2抗原蛋白的大腸桿菌的發(fā)酵方法，包括:
[0013](I)批培養(yǎng)階段:30L發(fā)酵罐的中發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為5?25L，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的重組大腸桿菌種子液按1%?3% (體積比)接種量接種至30L發(fā)酵罐中，控制溫度為35-38°C，通過流加25%的氨水調(diào)控pH值至6.0-7.5，不斷調(diào)節(jié)攪拌速度與通氣量，控制溶氧在10%，當(dāng)培養(yǎng)基中的甘油消耗完全時，溶氧出現(xiàn)陡升，開始進入補料培養(yǎng)階段；
[0014]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:胰蛋白胨10?25g/L，玉米漿I?20g/L，KH2P04 I?5g/L,K2HPO4 I?5g/L，酵母浸膏 10?25g/L，(NH4)2S04 0.I?I.5g/L，MgS04.7H20 0.1 —1.0g/L，NaCl I?15g/L，甘油I?15ml/L，余量是水，pH值為6.0?8.0。
[0015](2)補料培養(yǎng)階段:通過溶氧實時反饋，流加無菌的75 %葡萄糖溶液，控制菌體比生長速率為0.10-0.15，補料期間控制溶氧為10%。
[0016](3)誘導(dǎo)表達階段:當(dāng)發(fā)酵液中菌體OD6qq為60?70時添加IPTG，至IPTG終濃度為0.8?1.211^，誘導(dǎo)期間控制溫度為15-20°(3 4田直為6.0?8.0，控制溶氧為10%，誘導(dǎo)12?18h結(jié)束。
[0017 ]所述的重組大腸桿菌為表達crybb2抗原蛋白的大腸桿菌。
[0018]以上所述方案中，優(yōu)選的，表達crybb2抗原蛋白的重組大腸桿菌的制備方法包括:
[0019](l)crybb2基因的合成
[0020]人工合成的crybb2基因連接到pGEX_4T載體上得到重組質(zhì)粒pGEX_4T_crybb2。
[0021 ] (2)pET-28a_crybb2 質(zhì)粒的構(gòu)建
[0022]利用EcoRI+XholI 同時酶切 pGEX-4T-crybb2 和 pET-28a( + )，將酶切后 crybb2 基因片段與酶切后pET-28a( + )連接，構(gòu)建出pET-28a-crybb2質(zhì)粒。
[0023](3)轉(zhuǎn)化
[0024]將pET-28a_crybb2質(zhì)粒加入感受態(tài)細(xì)胞BL-21 (DE3)中，涂布平板，篩選陽性株，即得到表達crybb2抗原蛋白的重組大腸桿菌。
[0025](4)目的基因在大腸桿菌中的表達鑒定
[0026]將重組菌株培養(yǎng)并進行誘導(dǎo)表達后收集菌體，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和western blot，對蛋白進行鑒定。
[0027]以上所述方案中，優(yōu)選的，鑒定正確的重組大腸桿菌的種子液的制備過程包括:
[0028]將重組大腸桿菌在TSA平皿上活化后，挑取單克隆用20mlTSB種子培養(yǎng)基進行一次擴增，培養(yǎng)條件為37°C，200r/min，培養(yǎng)至OD6qq為1.0，得到一級種子液;再吸取6ml—級種子液用200ml TSB種子培養(yǎng)基進行二次擴增，培養(yǎng)條件為37°C，200r/min，培養(yǎng)至OD600為0.6，得到二級種子液;然后按3 %接種量接種至發(fā)酵罐中。
[0029]以上所述方案中，優(yōu)選的，發(fā)酵過程中每10個小時取樣鏡檢、并測定發(fā)酵液菌體密度、濕重和干重。發(fā)酵結(jié)束后通過SDS-PAGE檢測發(fā)酵液的目的蛋白。
[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0031]1.相較于其他的半合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基，本發(fā)明的提供的培養(yǎng)基在考慮操作可行性的前提下，需按其不同成分的化學(xué)性質(zhì)進行配制、滅菌、添加，以達到穩(wěn)定有效的發(fā)酵利用。
[0032]2.本發(fā)明是針對產(chǎn)胞內(nèi)crybb2抗原蛋白的重組大腸桿菌所設(shè)計的高密度高表達發(fā)酵培養(yǎng)基配方，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基配方既能保證供試菌株在一定的比生長速率情況下菌體生長代謝正常，得到較高的菌體量，又能使crybb2蛋白的表達量得到顯著提高，完全可以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的要求。
[0033]3.利用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基和發(fā)酵方法，本發(fā)明的培養(yǎng)基在發(fā)酵終點菌體量可達210g/L，每升發(fā)酵液的蛋白表達量可達17.6g，比常用商業(yè)培養(yǎng)基TSB培養(yǎng)基蛋白表達量提高了約3倍，而發(fā)酵生產(chǎn)成本降低了近60 %。
【附圖說明】
[0034]圖1 crybb2基因PCR擴增圖。
[0035]泳道I和2均為crybb2基因擴增圖。
[0036]圖2為本發(fā)明中pET-28a_crybb2質(zhì)粒圖譜示意圖。
[0037]圖3為本發(fā)明中重組抗原SDS-PAGE電泳。
[0038]泳道:1為marker;2為空質(zhì)粒PGEX-4T;3為重組菌(BL21DE(3)/pET28a-crybb2)未誘導(dǎo)；4 為重組菌(BL21DE(3)/pET28a-crybb2)誘導(dǎo) lh;5為重組菌(BL21DE(3)/pET28a-crybb2)誘導(dǎo)2h蛋白 ;6為為重組菌(BL21DE(3)/pET28a-crybb2)誘導(dǎo)3h蛋白；
[0039]圖4為實施例5中產(chǎn)crybb2蛋白的重組大腸桿菌BL21DE(3)/pET28a-crybb2在30L發(fā)酵罐中的菌體生長曲線示意圖。
【具體實施方式】
[0040]本發(fā)明實施例所用技術(shù)方案，如未特備說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案;所述試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業(yè)渠道。
[0041 ] 實施例1:
[0042]表達crybb2抗原蛋白的重組大腸桿菌BL21DE( 3) / pET28a_crybb2的構(gòu)建:
[0043](l)crybb2基因的合成
[0044]將crybb2基因(Genebank:CR456426.1)于上海生工生物工程有限公司合成，共615bp(SEQ ID N0.1所示)(圖1)，并連接到pGEX_4T載體上得到重組質(zhì)粒pGEX-4T_crybb2。
[0045](2)pET-28a-crybb2 質(zhì)粒的構(gòu)建
[0046]利用EcoRI+XholI (購自寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品)同時酶切pGEX-4T_crybb2的crybb2基因片段和pET-28a( + )，將酶切后crybb2基因片段與酶切后pET-28a( + )連接(圖2)，構(gòu)建出pET_28a_crybb2質(zhì)粒。
[0047](3)轉(zhuǎn)化
[0048]取感受態(tài)細(xì)胞BL-21(DE3)100yl加入到1.5mlEP管中，將pET-28a-crybb2質(zhì)粒0.5μI加入并混勻。置冰上30min后，42°C熱激90秒，冰浴3min-5min。將其涂布于含有25yg/mlKna的LB瓊脂平板。37°C正置lh，再將平板翻過來，倒置37°C培養(yǎng)14h?16h至菌落出現(xiàn)。得到的菌落為表達crybb2抗原蛋白的重組大腸桿菌BL2IDE(3)/pET28a_crybb2。
[0049](4)目的基因在大腸桿菌中的表達鑒定
[0050]將重組大腸桿菌BL21DE(3)/pET28a-crybb2接種于含有25yg/mlKna的3mL LB液體培養(yǎng)基，于37°C搖床培養(yǎng)。從培養(yǎng)好的菌液中取10yL接種于1mL含有25yg/ml Kna的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37°C振蕩培養(yǎng)約3h，至0D600達到0.6時，加IPTG至終濃度為1.2mmol/L，18°C繼續(xù)培養(yǎng)，3h后收集菌體。并進行SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳(圖3)及western blot對蛋白進行鑒定，鑒定結(jié)果表明，本實施例制備的重組大腸桿菌可正確表達crybb2蛋白，作為以下大型發(fā)酵培養(yǎng)的供試菌株。
[0051 ] 實施例2:
[0052]—種表達crybb2抗原蛋白的大腸桿菌的發(fā)酵方法，包括:
[0053]A.發(fā)酵培養(yǎng)基的配制:胰蛋白胨500g，玉米漿400g，KH2P04 100g,K2HP04 100g，酵母浸膏500g，(NH4)2S04 30g,MgSO4.7H20 20g，NaCl 300g，甘油300ml，溶于20L蒸餾水，調(diào)整pH值為7.5，轉(zhuǎn)移至301^發(fā)酵罐中，在1211高壓蒸汽下滅菌30!^11，冷卻后即為發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0054]B.補料培養(yǎng)階段葡萄糖的制備:稱取葡萄糖150g，并用蒸餾水溶解并定容至200ml，在115°C高壓蒸汽下滅菌25min冷卻后作為75%葡萄糖備用。當(dāng)滅菌溫度超過115°C時葡萄糖容易碳化，產(chǎn)生糠醛，對菌體的生長不利。
[0055]發(fā)酵種子液的制備:將重組大腸桿菌BL21DE(3)/pET28a_crybb2在TSA平皿上活化后，挑取單克隆用20ml TSB種子培養(yǎng)基進行一次擴增，培養(yǎng)條件為37°C