一種體外擴(kuò)增臍血cd34+細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種體外擴(kuò)增臍血⑶34+細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自1989年世界上首例臍血移植成功以來，人們己經(jīng)對臍血移植進(jìn)行了深入廣泛的研究。但到目前為止，臍血移植仍存在一些尚待解決的問題，主要在于臍血造血干/祖細(xì)胞(CD34+)數(shù)量少，使其目前主要應(yīng)用于兒童患者，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，如何擴(kuò)増臍血造造血干/祖細(xì)胞數(shù)量提高其植入率，縮短造血重建恢復(fù)時(shí)間，己經(jīng)成為目前人們對臍血移植研究的主要問題。
[0003]對臍血⑶34+細(xì)胞的體外擴(kuò)増，最初主要通過體外加入不同組合的細(xì)胞因子來達(dá)到擴(kuò)増的目的，但體外加入的細(xì)胞因子不能長期維持細(xì)胞的培養(yǎng)，需要不斷加以補(bǔ)充。之后，又建立了以骨髓基質(zhì)細(xì)胞為滋養(yǎng)層的臍血CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)増共培養(yǎng)體系，模擬體內(nèi)造血微環(huán)境，以長期持續(xù)地分泌細(xì)胞因子來維持臍血CD34+細(xì)胞的擴(kuò)増。然而，人骨髓基質(zhì)細(xì)胞來源受限且臍血CD34+細(xì)胞與成人骨髓CD34+細(xì)胞具有不同的生物學(xué)特性。
[0004]因此，如何擴(kuò)増臍血造造血干/祖細(xì)胞數(shù)量，提高其植入率，縮短造血重建恢復(fù)時(shí)間，己經(jīng)成為目前人們對臍血移植研究的主要問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明解決的技術(shù)問題是針對以上不足，提供一種體外擴(kuò)增臍血CD34+細(xì)胞的方法，為臍血CD34+細(xì)胞的的擴(kuò)增建立適合的培養(yǎng)條件，提高其植入率，縮短造血重建恢復(fù)時(shí)間。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種體外擴(kuò)增臍血CD34+細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
[0007](I)臍血的采集及預(yù)處理:
[0008]無菌條件下從正常分娩足月新生兒胎盤抽取臍帶血30?50ml，加入肝素抗凝，以新生兒血清或成人的血清做為預(yù)處理的媒介，將臍帶血與新生兒血清或成人的血清按照1:
1.5d的比例混勻，-15°c冷藏30分鐘；
[0009](2)臍血的分離:
[0010]預(yù)處理后的臍帶血與Hank’s液按體積比例為2:1混合，取一10ml離心管，加入Ficol1-Paque分離液15?25ml，將臍帶血混合液30?50ml緩慢加于分離液上，1800r/min,離心16?20min，離心結(jié)束后，離心管中液體分層，吸取白色霧狀單個(gè)核細(xì)胞層到一新10ml離心管中；
[0011](3)臍血CD34+細(xì)胞的純化:
[0012]用紅細(xì)胞裂解液(ACKLysis Buffer)除去紅細(xì)胞，再用PBS清洗單核細(xì)胞2?3次，計(jì)數(shù)，按I X 17個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種到含培養(yǎng)基I的75cm2培養(yǎng)瓶中；使用磁性細(xì)胞分選儀和CD34+細(xì)胞分選試劑盒分離和純化CD34+細(xì)胞；
[0013](4)臍血⑶34+細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng):
[0014]臍血CD34+細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基Π中，按I X 10Vml接種于6孔板中，每孔2.5ml，在37°C、5 % CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)4周，每周半量換液一次；
[0015](5)測定⑶34+擴(kuò)増的細(xì)胞的造血祖細(xì)胞集落(CFC)形成能力:
[0016]吸取足量的培養(yǎng)基m到注射器中，并分裝到滅菌試管中，按1:10(v/v)的比例將細(xì)胞添加到培養(yǎng)基m中，扭緊試管蓋，振搖試管，以保證所有的成份充分混勻，用頂DM+2%FBS稀釋至合適濃度，在6孔培養(yǎng)板中每孔接種2 X 13個(gè)細(xì)胞，37°C，5 % CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)培養(yǎng)2周，在倒置顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，40個(gè)以上細(xì)胞為I個(gè)集落。
[0017]進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基I是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成分組成，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)液，所述添加成分為:谷氨酰胺I?2.5ug/mL、i3-巰基乙醇1%(ν/ν)、碳酸氫鈉2?3.5ug/mL、膜島素I?5ug/mL、bFGF 15?18ng/mL、維生素C 30?50ug/mL。
[0018]進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基Π配方如下:50?120ml胎牛血清、10?25ml非必需氨基酸，Iml谷氨酰胺、2?8μ1β-巰基乙醇、1.0?1.5ml胰島素、I?4μ1Ν-乙酰-L-半胱氨酸、3?20yg細(xì)胞因子GM-CSF(購于美國PeproTech公司)、I?5yg肥大細(xì)胞生長因子(MGF)、0.2?1.0yg粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)、0.3?2.0yg白細(xì)胞介素8、重組人白介素-11。細(xì)胞因子GM-CSF、肥大細(xì)胞生長因子(MGF)、粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)、白細(xì)胞介素8—起誘導(dǎo)細(xì)胞增生、延長其存活期。
[0019]進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基ΙΠ是在MethoCult培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入重組細(xì)胞因子，所述重組細(xì)胞因子包括:G-CSF 50ng/ml、IL-ll 10ng/ml、IL-Ιβ 10ng/ml、EP0 6U/ml。
[0020]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果體現(xiàn)為:采用發(fā)明的培養(yǎng)方法臍血細(xì)胞培養(yǎng)4周后，可大大擴(kuò)増臍血⑶34+細(xì)胞和CFC，臍血⑶34+細(xì)胞擴(kuò)増倍數(shù)在地2周可達(dá)(9.0 士4.5)倍，CFC擴(kuò)増?jiān)诘贗周時(shí)達(dá)到峰值，說明本發(fā)明建立的培養(yǎng)體系及其培養(yǎng)條件對臍血CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增具有明顯的支持作用。
【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例1:
[0022]一種體外擴(kuò)增臍血⑶34+細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
[0023](I)臍血的采集及預(yù)處理:
[0024]無菌條件下從正常分娩足月新生兒胎盤抽取臍帶血30ml，加入肝素抗凝，以新生兒血清或成人的血清做為預(yù)處理的媒介，將臍帶血與新生兒血清或成人的血清按照1:1.5d的比例混勻，-15°C冷藏30分鐘；
[0025](2)臍血的分離:
[0026]預(yù)處理后的臍帶血與Hank’s液按體積比例為2:1混合，取一10ml離心管，加入Ficol 1-Paque分離液15ml，將臍帶血混合液30ml緩慢加于分離液上，1800r/min，離心16min，離心結(jié)束后，離心管中液體分層，吸取白色霧狀單個(gè)核細(xì)胞層到一新10ml離心管中；
[0027](3)臍血⑶34+細(xì)胞的純化:
[0028]用紅細(xì)胞裂解液(ACKLysis Buffer)除去紅細(xì)胞，再用I3BS清洗單核細(xì)胞2次，計(jì)數(shù)，按I X 17個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種到含培養(yǎng)基I的75cm2培養(yǎng)瓶中；所述培養(yǎng)基I是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成分組成，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)液，所述添加成分為:谷氨酰胺Iug/mL、0-巰基乙醇I % (v/v)、碳酸氫鈉2ug/mL、胰島素l/mL、bFGF 15ng/mL、維生素C 30ug/mL；使用磁性細(xì)胞分選儀和CD34+細(xì)胞分選試劑盒分離和純化CD34+細(xì)胞；
[0029](4)臍血⑶34+細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng):
[0030]按下述配方配制培養(yǎng)基Π:50ml胎牛血清、1ml非必需氨基酸，Iml谷氨酰胺、2μ1β-巰基乙醇、1.0ml胰島素、ΙμΙΝ-乙酰-L-半胱氨酸、3yg細(xì)胞因子GM-CSF(購于美國PeproTech公司)、Iyg肥大細(xì)胞生長因子(MGF)、0.2yg粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)、0.3yg白細(xì)胞介素8、重組人白介素-11，細(xì)胞因子GM-CSF、肥大細(xì)胞生長因子(MGF)、粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)、白細(xì)胞介素8—起誘導(dǎo)細(xì)胞增生、延長其存活期；臍血CD34+細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基Π中，按I X 1fVml接種于6孔板中，每孔2.5ml，在37°C、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)4周，每周半量換液一次；
[0031 ] (5)測定⑶34+擴(kuò)増的細(xì)胞的造血祖細(xì)胞集落(CFC)形成能力:
[0032]吸取足量的培養(yǎng)基ΙΠ到注射器中，所述培養(yǎng)基ΙΠ是在MethoCult培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入重組細(xì)胞因子，所述重組細(xì)胞因子包括:G-CSF 50ng/ml、IL-ll 10ng/ml、IL-Ιβ 1ng/mKEPO 6U/ml;然后分裝到滅菌試管中，按1:10(v/v)的比例將細(xì)胞添加到培養(yǎng)基ΙΠ中，扭緊試管蓋，振搖試管，以保證所有的成份充分混勻，用MDM+2%FBS稀釋至合適濃度，在6孔培養(yǎng)板中每孔接種2 X 13個(gè)細(xì)胞，37°C，5 %CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)培養(yǎng)2周，在倒置顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，40個(gè)以上細(xì)胞為I個(gè)集落。
[0033]實(shí)施例2:
[0034]一種體外擴(kuò)增臍血⑶34+細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
[0035](I)臍血的采集及預(yù)處理:
[0036]無菌條件下從正常分娩足月新生兒胎盤抽取臍帶血40ml，加入肝素抗凝，以新生兒血清或成人的血清做為預(yù)處理的媒介，將臍帶血與新生兒血清或成人的血清按照1:1.5d的比例混勻，-15°C冷藏30分鐘；
[0037](2)臍血的分離:
[0038]預(yù)處理后的臍帶血與Hank ’ s液按體積比例為2:1混合，取一 1 OmI離心管，加入Ficol 1-Paque分離液20ml，將臍帶血混合液40ml緩慢加于分離液上，1800r/min，離心18min，離心結(jié)束后，離心管中液體分層，吸取白色霧狀單個(gè)核細(xì)胞層到一新10ml離心管中；
[0039](3)臍血⑶34+細(xì)胞的純化:
[0040]用紅細(xì)胞裂解液(ACKLysis Buffer)除去紅細(xì)胞，再用I3BS清洗單核細(xì)胞2次，計(jì)數(shù)，按I X 17個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種到含培養(yǎng)基I的75cm2培養(yǎng)瓶中；所述培養(yǎng)基I是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成分組成，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)液，所述添加成分為:谷氨酰胺1.75ug/mL、0-巰基乙醇I % (v/v)、碳酸氫鈉2.75ug/mL、胰島素3ug/mL、bFGF 16.5ng/mL、維生素C 40ug/mL;使用磁性細(xì)胞分選儀和⑶34+細(xì)胞分選試劑盒分離和純化⑶34+細(xì)胞；
[0041 ] (4)臍血⑶34+細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng):
[0042]按下述配方配制培養(yǎng)基Π:850ml胎牛血清、17.5ml非必需氨基酸，Iml谷氨酰胺、5μ?β-巰基乙醇、1.251111胰島素、2.5411乙酰-1^-半胱氨酸、11.548細(xì)胞因子61-03?(購于美國PeproTech公司)、3yg肥大細(xì)胞生長因子(MGF)、0.6yg粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)、1.15yg白細(xì)胞介素8、重組人白介素-11，細(xì)胞因子GM-CSF、肥大細(xì)胞生長因子(MGF)、粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)、白細(xì)胞介素8—起誘導(dǎo)細(xì)胞增生、延長其存活期;臍血CD34+