Egfl8基因過表達慢病毒及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及基因工程技術領域，尤其設及一種Egfl8基因過表達慢病毒及其構建 方法和在制備治療肝癌藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] E奸 18(邱idermal growth factor-Uke domain 8,表皮生長因子樣結構域8)是 由Fitdi等于2004年首先在小鼠中發(fā)現(xiàn)，其位于小鼠的17號染色體上，編碼一個由293個氨 基酸組成的蛋白。人Egfl8基因則位于第6號染色體上(6P21.32)，與MHC區(qū)域相鄰，編碼一個 分子量為32KD的分泌型蛋白。蛇fl8蛋白包含有一個EGF樣結構域、一個巧離子結合型EGF樣 結構域和N末端的信號膚。
[0003] 近年來，已研究證實Egfl8在結直腸癌組織中的表達明顯下調(diào)，且其低表達與結直 腸癌的遠處轉(zhuǎn)移、?M分期及不良預后密切相關。此外，Egfl8在胃癌組織中亦呈低表達，且 其表達水平的下調(diào)與胃癌的腹膜播散及?M分期密切相關。運些結果提示Egfl8在人類惡性 腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。而國際上最新的研究顯示，下調(diào)小鼠胸腺上皮細胞中 E奸18的表達可使細胞粘附分子I CAM-1的表達明顯上調(diào)，上調(diào)蛇f 18的表達則可使I CAM-1的 表達明顯下調(diào)，即E奸18對胸腺上皮細胞中ICAM-1的表達具有反向調(diào)控的作用。此外，體內(nèi) 注射重組的蛇fl8蛋白可抑制小鼠胸腺組織中Notch信號傳導通路的表達。
[0004] 綜上所述，目前國內(nèi)外對于Egfl8的研究，大多是集中于Egfl8在腫瘤組織中的表 達情況及其與腫瘤惡性程度及臨床表現(xiàn)的相關性等方面，而對于Egf 18在人類惡性腫瘤尤 其是肝癌組織中的作用及機制等方面研究較少。Egfl8在細胞系中的研究也僅見于胸腺上 皮細胞，并且目前又缺少高效穩(wěn)定上調(diào)腫瘤細胞中Egf 18表達的手段和方式。因此，構建 Egfl8過表達慢病毒載體及相應慢病毒，觀察其感染腫瘤細胞后所產(chǎn)生的作用，對于研究 Egfl8在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及機制都十分重要。目前，尚未見到關于構建蛇fl8過表達 慢病毒的研究和報道，也尚無任何研究報道蛇fl8在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種Egfl8基因過表達慢病毒及其 構建方法和應用，W高效便捷地實現(xiàn)Egf 18基因在肝癌細胞中的穩(wěn)定過表達，通過感染 HCCLM3肝癌細胞系，從而抑制該肝癌細胞系的遷移運動能力。
[0006] 本發(fā)明的目的通過W下技術方案予W實現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明提供的一種Egf 18基因過表達慢病毒，包括含目的基因的GV208-蛇f 18慢病 毒載體、W及慢病毒包裝輔助載體抑elper 1.0質(zhì)粒和pHelper 2.0質(zhì)粒;所述GV208-Egfl8 慢病毒載體包括GV208慢病毒表達載體、WEgfl8cDNA克隆為模板的Egfl8cDNAPCR產(chǎn)物； 其中PCR擴增引物為：
[000引 E奸18上游引物：
[0009] GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGGTCCAGGGCTGAGCTGTGCACTC(序列 1)
[0010] E奸18下游引物：
[0011] TCACCATGGTGGCGACCGGTCGATGATTGACGCCGAGGC(序列2)。
[0012] 本發(fā)明提供的上述蛇fl8基因過表達慢病毒的構建方法，包括W下步驟：
[001引（1化奸18過表達慢病毒載體的構建
[0014] (l-l)WEgfl8 cDNA克隆為模板，采用上述PCR擴增引物，通過PCR反應，擴增獲得 E奸 18 cDNA PCR產(chǎn)物；
[001引（1-2)GV208慢病毒表達載體進行Age I酶切，得到線性化的GV208慢病毒表達載 體；
[0016] (1-3)將蛇fl8 cDNA PCR產(chǎn)物交換入線性化的GV208慢病毒表達載體，將得到的連 接液轉(zhuǎn)化新鮮的感受態(tài)大腸桿菌細胞;并進行PCR鑒定；
[0017] (1-4)PCR鑒定采用的引物為：
[001 引 上游:CGGTGAATGCTGGTGGCATC(序列3);
[0019] 下游：TCACCATGGTGGCGACCGGGCTCACACTCAACTGGGC(序列4);
[0020] 對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和比對，比對正確的克隆即為構建成功的含目的 基因的GV208-E奸18慢病毒載體；
[0021] (2化奸18過表達慢病毒的構建
[0022] 將所述GV208-Egfl8慢病毒載體、W及慢病毒包裝輔助載體pHelper 1.0質(zhì)粒和 P化Iper 2.0質(zhì)粒，同時共轉(zhuǎn)染人胚腎細胞293T細胞，在該細胞中進行病毒的包裝并分泌到 細胞外的培養(yǎng)基中，收集培養(yǎng)基離屯、后取得的上清液，經(jīng)離屯、濃縮即為包含GV208-E奸18質(zhì) 粒的蛇f 18過表達慢病毒。
[0023] 本發(fā)明還提供了上述Egfl8過表達慢病毒在制備治療肝癌藥物中的應用，W及包 括上述蛇fl8過表達慢病毒的藥物組合物。
[0024] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0025] 本發(fā)明首次構建了 Egfl8過表達慢病毒，能夠高效便捷地感染肝癌細胞并明顯上 調(diào)后者中Egfl8基因的表達，能夠有效降低肝癌細胞的侵襲運動能力，從而為肝癌的治療提 供了Egfl8基因運樣一個非常有效的抑制基因，為開發(fā)相應的基因治療措施提供了一種行 之有效的方法，對于肝癌的蛇fl8基因治療藥物的制備具有重大意義。
【附圖說明】
[0026] 下面將結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述：
[0027] 圖1是GV208質(zhì)粒DNA圖譜；
[0028] 圖 2 是pHelper 1.0質(zhì)粒 DNA圖譜；
[00巧]圖3是pHelper 2.0質(zhì)粒DNA圖譜；
[0030] 圖4是Egfl8過表達慢病毒及陰性對照慢病毒感染HCCLM3肝癌細胞后的結果示意 圖（NC:陰性對照組;0E:E奸18過表達組）；
[0031] 圖5是蛇fl8過表達慢病毒及陰性對照慢病毒感染HCCLM3肝癌細胞后Egfl8蛋白表 達水平示意圖（A:Weste;rn blot檢測Egfl8表達的結果；B:Weste;rn blot結果統(tǒng)計直方圖； NC:陰性對照組;0E: E奸18過表達組;CON:空白組）；
[0032] 圖6是Egfl8過表達慢病毒及陰性對照慢病毒感染HCCLM3肝癌細胞后侵襲實驗的 結果示意圖（A:Transwell小室聚碳脂膜拍照照片;B:侵襲實驗結果統(tǒng)計直方圖;NC:陰性對 照組;0E: E奸18過表達組;CON:空白組）；
[0033] 圖7是Egf 18過表達慢病毒及陰性對照慢病毒感染HCCLM3肝癌細胞后劃痕實驗的 結果統(tǒng)計直方圖（NC:陰性對照組;0E:蛇f 18過表達組;CON:空白組）。
【具體實施方式】
[0034] 圖1~圖7所示為本發(fā)明Egfl8基因過表達慢病毒及其構建方法和應用的實施例， 通過設計和構建人Egfl8基因過表達慢病毒，W高效感染肝癌細胞并明顯上調(diào)后者中蛇fl8 基因的表達，從而有效降低肝癌細胞的侵襲運動能力。
[0035] 1、構建蛇f 18過表達慢病毒載體
[0036] WEgf 18 cDNA克隆(BC052591)為模板，設計PCR擴增引物如表1所述（同序列表中 序列1和序列2)，通過PCR反應（反應體系及條件分別見表2和表3)，擴增獲得大小925bp的 PCR產(chǎn)物。GV208慢病毒表達載體DNA圖譜見圖1，對其進行Age I酶切，酶切體系見表4，酶切 條件為37°C解育化。將Egfl8 cDNA PCR產(chǎn)物交換入線性化慢病毒表達載體，連接反應體系 見表5,反應條件為25°C解育30分鐘，再42°C解育15min。將連接液轉(zhuǎn)化新鮮的感受態(tài)大腸桿 菌細胞(轉(zhuǎn)化操作參考:分子克隆實驗指南第二版55-56頁）。
[0037] 表1.蛇fl8 cDNA PCR擴增引物
[00；3 引
[0039] 引物說明：含交換配對堿基、酶切位點（下劃線標記的）、表達增強序列（雙下劃線 標記的似及目的基因5'端部分序列用于PCR釣取目的基因
[0040] 表2.蛇fl8 cDNA PCR擴增反應體系
[0041]
[0042] ~表3.PCR擴增反應體系
' '
[0043]
[0044] 表4.GV208慢病毒載體酶切反應體系
[0045]__
[0049] 說明：a)加入的線性化載體DM和純化的PCR產(chǎn)物的摩爾數(shù)比例為1:3~1:9之間
[0050] b)陽性對照加入的純化PCR產(chǎn)物為GAPDH基因（同樣帶有交換臂）
[0051] 針對GV208慢病毒表達載體中目的基因序列的上下游設計PCR鑒定引物(見表6,同 序列表中序列3和序列4)，進行PCR鑒定實驗(PCR反應體系見表7，PCR反應條件見表8)，對 PCR鑒定陽性的克隆進行測序和比對，比對正確的克隆即為構建成功的含有Egfl8基因序列 的慢病毒表達載體，命名為GV208-E奸18慢病毒載體。
[0化2] 表6.PCR鑒定引物序列
[0化3]_
[0化6]表8.PCR鑒定反應條件
[0化7]
[005引2、E奸18過表達慢病毒及陰性對照慢病毒的構建
[0059] WQiagen公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取GV208-Egfl8慢病毒載體質(zhì)粒及慢病毒包裝 輔助載體抑elper 1.0質(zhì)粒(DNA圖譜見圖2)和抑elper 2.0質(zhì)粒(DNA圖譜見圖3)，質(zhì)粒DNA 溶于除菌的TE中，W紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所有質(zhì)粒DNA的A260/A280在1.8 ~2.0之間。轉(zhuǎn)染前24h，用膜蛋白酶消化對數(shù)生長期的人胚腎細胞293T細胞，W含10 %胎牛 血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1.2 X107細胞/20mL，重新接種于15cm細胞培養(yǎng)皿，37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后待細胞密度達70 %~80 %時即可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前化將細 胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。向一滅菌離屯、管中加入所制備的GV208-Egf 1