一種降解多環(huán)芳烴的微生物膜菌劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及降解多環(huán)芳控的微生物膜菌劑構(gòu)建技術(shù)，特別設(shè)及一種降解污染±壤 中多環(huán)芳控的高效微生物膜菌劑及其制備方法。 技術(shù)背景
[0002] 隨著我國工業(yè)化、農(nóng)業(yè)集約化、城市化和交通現(xiàn)代化等的快速發(fā)展，多環(huán)芳控 (化ly巧clic AromatiC Hy化ocarbons，PAHs)排放量激增，致使±壤PAHs污染日趨嚴(yán)重，嚴(yán) 重威脅了±壤生態(tài)環(huán)境、農(nóng)產(chǎn)品安全和人體健康，并影響到我國社會經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。因 此，針對±壤污染特點(diǎn)，調(diào)控影響±壤凈化功能的關(guān)鍵過程，研發(fā)PAHs污染±壤修復(fù)技術(shù)是 改善±壤環(huán)境質(zhì)量的有效措施。
[0003] 污染±壤方法主要包括物理方法、化學(xué)方法和生物方法。生物修復(fù)，尤其微生物修 復(fù)有機(jī)物污染上壤比其它方法更加廉價(jià)高效。它主要是利用經(jīng)篩選、馴化的專性微生物或 基因工程菌降解或生物代謝±壤中的毒害污染物。但是，外源功能菌由于不適應(yīng)場地條件 和復(fù)雜的自然環(huán)境，難W同±著菌競爭，其數(shù)量或活性通常迅速衰減乃至消失；菌體易流 失;有效菌濃度低；導(dǎo)致生化反應(yīng)啟動速度慢;環(huán)境耐性差;最終不能確保持續(xù)較高的修復(fù) 效率。因此，確保外源菌的成活是決定多環(huán)芳控污染±壤微生物修復(fù)效果的關(guān)鍵因素。微生 物膜表面胞外聚合物含有多糖、蛋白質(zhì)、核酸等有機(jī)組分，其組成與微生物膜的種類、載體 表面特性和外界環(huán)境條件等密切相關(guān)，能夠使微生物固定在某一特定的位置，從而使微生 物在底物的選擇和利用方面專一性更強(qiáng)，并能夠在長時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定的較強(qiáng)的代謝活性。 因而，將微生物膜技術(shù)引入生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域能夠加快微生物利用多環(huán)芳控的速率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種可利用和降解多環(huán)芳控的微生物膜菌劑及其制備方法，該 微生物菌劑具有制備方法簡單，對特定多環(huán)芳控具有高降解活性，特別是對污染±壤中的 多環(huán)芳控降解具有高活性。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是:將微生物發(fā)酵，與經(jīng)過處理后的胡敏素共混在好氧條件下 培養(yǎng)，至胡敏素顆粒表面形成特定的微生物膜，即得到所述的多環(huán)芳控降解菌劑。具體步驟 包括：
[0006] (1)微生物發(fā)酵液的制備:首先將微生物接種至無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，W菲為碳源，培 養(yǎng)24~72h至指數(shù)生長期；調(diào)節(jié)微生物ODsqq值至0.7~0.8,按照1~2:100轉(zhuǎn)入罐發(fā)酵13~ 1化。
[0007] (2)胡敏素處理:將胡敏素在280°C下烘烤2~化，然后研磨成粒徑小于1(Κ)μπι的細(xì) 小顆粒，得到經(jīng)處理后的胡敏素。
[000引（3)將微生物發(fā)酵液與經(jīng)過處理后的胡敏素按重量比（1~4): 1混合，在好氧條件 下培養(yǎng)，至胡敏素顆粒表面形成微生物膜，即得到所述的多環(huán)芳控降解菌劑。
[0009]所述步驟（1)的微生物菌株由多環(huán)芳控污染±壤中篩選、分離得到，具體為 Mycobacterium sp.NJS-P，Mycobacterium sp.NJS-1，Sphingobium sp.PHE3,Micrococcus sp. P肥9中的一種或者組合。
[0010] 所述步驟（1)中發(fā)酵溫度25-30°C、壓力ο.03-0.05MPa、通氣量為ο. 1-1.ον V-Vin -1、攬拌速度300rpm min-i。
[0011] 所述步驟(2)經(jīng)過處理后胡敏素中C、H、N、S元素的含量分別為51.30~52.28%， 2.69~2.75%，1.27~1.32%，0.47~0.56%。
[001^ 所述步驟(3)中好氧培養(yǎng)溫度28~35°C，搖床轉(zhuǎn)速90~lOOr min-i，培養(yǎng)時(shí)間10~ 1化。
[0013] 所述微生物菌劑按照重量比1:100分散于憐酸緩沖液，胞外蛋白、多糖含量分別為 55.4~85.8111邑[1和10.3~13.6111邑[1。
[0014] 本發(fā)明的特點(diǎn)在于：
[0015] 1、該微生物膜菌劑制備過程簡單，操作方便，發(fā)酵周期短。
[0016] 2、本方法制備的微生物膜菌劑，經(jīng)過生長特性及酶活測定，具有生長速度快、酶活 力高等特點(diǎn)。
[0017] 3、本微生物膜菌劑具有利用和降解多環(huán)芳控的功效，可作為常年除去污染±壤中 多環(huán)芳控的手段。
[0018] 4、本微生物膜菌劑的胞外蛋白、多糖能夠吸附多環(huán)芳控，減少多環(huán)芳控的毒性。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明中所設(shè)及的生物材料均為已公開的生物材料，可向相關(guān)保藏機(jī)構(gòu)獲取。
[0020] Mycobacterium sp.NJS-P,Mycobacterium sp.NJS-l(Zeng J.,Lin X.G.,Zhang J.,Zhu H.,Chen H.and Wong M.H.2013. Successive transformation of benzo[a] pyrene by 1曰cc曰se of Tr曰metes versicolor 曰nd pyrene-degr曰ding Mycob曰cterium strains,97:3183-3194.)保藏號分別為：No.CCTCC M 2011011，No.CGMCC 1.10964，
[0021] S地ingobiumsp.P肥3,Mic;rococ州ssp.P肥9(Zhang,Y.P.,WangF.,化ngX丄.， Gu C.G.,Kengara F.0.,Hong Q.,Lv,Z.Y.,and Jiang X.,2011.Extracellular polymeric substances enhanced mass transfer of polycyclic aromatic hydrocarbons in the two-liquid-phase system for biodegradation. Applied Microbiology and Biotechnology，90:1063-1071.)保藏號分別為：No.CCTCC AB 2010361,N〇.CCTCC AB 2010362
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 1-1、微生物膜菌劑的制備
[0024] 將菌株Mycobacterium sp.NJS-P活化，然后接種于250血無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，W濃度 3g L-1的菲為碳源，在溫度30°C，轉(zhuǎn)速16化min-i條件下培養(yǎng)72h。然后采用無機(jī)鹽清洗并調(diào) 節(jié)ODsqq值至0.7，體積約為200mL。隨后，按照比例1: 50轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐，維持溫度30°C、壓力 0.05MPa、通氣量為0.4V y-Vin-i、攬拌速度300rpm min-i、發(fā)酵15h，既得微生物發(fā)酵菌懸 液。然后，取lOOg胡敏素于280°C烘烤化，冷卻后添加300mL微生物發(fā)酵菌懸液，隨后振蕩培 養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度是28°C，轉(zhuǎn)速設(shè)置為10化mirfi，最終得到微生物膜菌劑。
[0025] 1-2、微生物膜菌劑降解多環(huán)芳控
[00%]在燒杯中加入巧50mg，±壤500邑，攬拌均勻，保持田間持水量約60 %，置于培養(yǎng)箱 中平衡2地。隨后，添加微生物膜菌劑25g，再次混合均勻，置于培養(yǎng)箱中，常溫下進(jìn)行降解實(shí) 驗(yàn)。設(shè)置兩組對照，一組不接種微生物對照，測定巧的揮發(fā)量。另一組接種游離單株菌懸液 300mL，確定游離單株菌降解巧的量。培養(yǎng)14天后，測定±壤中巧的殘留量、±壤水分、計(jì)算 降解巧的量。結(jié)果見附表1。
[0027]表1:菌株Mycobacterium sp.NJS-P降解±壤中的巧 [002引
[0029] 實(shí)施例2
[0030] 2-1、微生物膜菌劑的制備
[0031] 生物膜菌劑制備過程:將菌株Mycobacterium sp.NJS-1活化，然后接種于250mL無 機(jī)鹽培養(yǎng)基中，