普通生酮基古龍酸菌速生型產(chǎn)酸菌株的高通量篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種微生物菌種選育方法，特別是一種普通生酬基古龍酸菌速生型產(chǎn) 酸菌株的高通量篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素 C是人體必需的維生素，生理作用廣泛，在醫(yī)藥和食品工業(yè)中均占有重要地 位。目前國內(nèi)普遍采用"二步發(fā)酵法"生產(chǎn)，第一步:單菌發(fā)酵，將D-山梨醇轉(zhuǎn)化成心山梨糖； 第二步:混合菌發(fā)酵，通過普通生酬基古龍酸菌Ketogulonogenium vulgarum(俗稱小菌)和 巨大芽抱桿菌Bacillus megaterium(俗稱大菌）的共同作用將k山梨糖轉(zhuǎn)化成2-酬基-L- 古龍酸;2-酬基-1^-古龍酸再經(jīng)過提取和轉(zhuǎn)化生成維生素 C。
[0003] 在"二步發(fā)酵法"生產(chǎn)維生素 C的過程中混合菌發(fā)酵，通過普通生酬基古龍酸菌和 巨大芽抱桿菌的共同作用將k山梨糖轉(zhuǎn)化成2-酬基-k古龍酸是生產(chǎn)維生素 C的關(guān)鍵步驟， 它決定著維生素 C的發(fā)酵產(chǎn)率和成本，在此過程中，普通生酬基古龍酸菌是產(chǎn)酸菌，巨大芽 抱桿菌是伴生菌，不產(chǎn)酸，因此選育普通生酬基古龍酸菌速生型產(chǎn)酸菌株，縮短發(fā)酵周期， 就成為節(jié)能降耗、提高設(shè)備利用率、增大維生素 C產(chǎn)量的關(guān)鍵。
[0004] 但是普通生酬基古龍酸菌的產(chǎn)酸性能受多基因控制，需要經(jīng)過多輪次的誘變選育 和大覆蓋面的批量篩選才能得到正突變菌株，通常使用的篩選方法為:將經(jīng)過誘變處理的 菌體懸浮液稀釋后均勻涂布于常規(guī)的分離培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，然后挑取存活的單菌落采用 劃線法進(jìn)一步富集培養(yǎng)，再分別接種于種液培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)酸性能檢測，根 據(jù)每個(gè)菌株的生長產(chǎn)酸情況判定取舍。運(yùn)樣的方法存在W下不足:一是經(jīng)過誘變處理，即使 是產(chǎn)酸性能得到改變的菌株其菌落形態(tài)和菌體形態(tài)等表型特征也幾乎沒什么改變，難W鑒 另IJ，因此對正突變菌株的挑選沒有目的性，而為了避免漏選，對誘變后存活的單菌落基本上 是全部選擇，篩選量巨大;二是進(jìn)行菌株生長代謝檢測采用的培養(yǎng)容器為裝液量和容積比 較大的試管或Ξ角瓶，要求待檢菌株的量也相應(yīng)較大，需要先將單菌落做富集培養(yǎng)，運(yùn)樣不 僅又增加了 3天左右的培養(yǎng)時(shí)間，而且還增加培養(yǎng)裝置?；谏鲜鲈?，為了簡化篩選工藝、 提高篩選效率和準(zhǔn)確性，建立一套新的普通生酬基古龍酸菌速生型產(chǎn)酸菌株的高通量篩選 方法，就成為當(dāng)前亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有普通生酬基古龍酸菌速生型產(chǎn)酸菌株選育技術(shù) 的不足，而提供一種基于特征指示劑鑒別與離屯、管組培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合、簡便、快速、高效高 通量選育普通生酬基古龍酸菌速生型產(chǎn)酸菌株的方法，即一種普通生酬基古龍酸菌速生型 產(chǎn)酸菌株的高通量篩選方法。
[0006] 本發(fā)明的目的可W通過下述的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0007] 運(yùn)種基于特征指示劑鑒別與離屯、管組培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合、簡便、快速、高效高通量選 育普通生酬基古龍酸菌速生型產(chǎn)酸菌株的方法，包括如下步驟：
[000引（1)w普通生酬基古龍酸菌化etogulonogenium vulgarum)為出發(fā)菌株進(jìn)行誘變 處理，獲取經(jīng)誘變處理的菌體懸浮液；
[0009] (2)將經(jīng)過誘變處理的菌體懸浮液稀釋后涂布于含有一定劑量指示劑的鑒別用固 體培養(yǎng)基平板上，31 ± 3°C靜置培養(yǎng)48~96h;
[0010] (3)從鑒別用固體培養(yǎng)基平板上生長出的普通生酬基古龍酸菌單菌落中挑取在靜 置培養(yǎng)期內(nèi)周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)變色圈且顏色由藍(lán)綠變?yōu)辄S色的單菌落，分別接種于一支裝有 含有一定劑量指示劑的鑒別用種液培養(yǎng)基的離屯、管中，每N支離屯、管組成一個(gè)離屯、管組，作 為一個(gè)培養(yǎng)單元置于搖床中，31 ±3°C振蕩培養(yǎng)，期間根據(jù)離屯、管中種液的顏色變化，挑取 在較短時(shí)間內(nèi)顏色由藍(lán)綠變?yōu)辄S色的離屯、管中種液作為高產(chǎn)酸種液；
[0011] (4)將挑取的高產(chǎn)酸種液稀釋后涂布于分離培養(yǎng)基平板上，31±3°C靜置培養(yǎng)48~ 72h，挑取飽滿個(gè)大的單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，即得到純化高產(chǎn)的普通生酬基古龍酸菌速生型 產(chǎn)酸菌株；
[0012] 所述鑒別用固體培養(yǎng)基的組成為：山梨糖10~20g/L、酵母膏2~6g/L、玉米漿2~ 6g/L、蛋白腺5~lOg/L、尿素0.5~2g/L、MgS〇4 · 7此0 0.05~0.2g/L、K此P〇4 0.5~2g/L、 CaC03 0.5~2g/L、指示劑0.01~0.1g/L、瓊脂10~化g/L，pH7.0~7.5;
[0013] 所述鑒別用種液培養(yǎng)基的組成為：山梨糖10~20g/L、酵母膏2~6g/L、玉米漿2~ 6g/L、蛋白腺5~lOg/L、尿素0.5~2g/L、MgS〇4 · 7出0 0.05~0.2g/L、K出P〇4 0.5~2g/L、指 示劑0.005~0.05g/L，pH6.8~7.2;
[0014] 所述鑒別用固體培養(yǎng)基和鑒別用種液培養(yǎng)基中加入的指示劑可W是漠百里酪藍(lán)， 或加有適量漠甲酪紫的漠百里酪藍(lán)、漠甲酪紫混合物，或加有適量甲基紅的漠百里酪藍(lán)、甲 基紅混合物，或加有適量漠甲酪紫和甲基紅的漠百里酪藍(lán)、漠甲酪紫、甲基紅混合物。
[0015] 本發(fā)明所提供的運(yùn)種普通生酬基古龍酸菌速生型產(chǎn)酸菌株的高通量篩選方法，它 基于特征指示劑鑒別與離屯、管組培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，特征指示劑鑒別是在鑒別用的固體培養(yǎng) 基和鑒別用的種液培養(yǎng)基中加入一定劑量的指示劑，空白的鑒別用固體培養(yǎng)基和空白的鑒 別用種液培養(yǎng)基顏色呈藍(lán)綠色，當(dāng)接入普通生酬基古龍酸菌單菌落后，隨著菌株的生長和 代謝產(chǎn)酸，菌株周圍的培養(yǎng)基pH逐漸下降，顏色逐漸變黃，而且菌株生長產(chǎn)酸越快顏色變化 越早，產(chǎn)酸量越高變色范圍越大越偏黃，反證菌株生長越快、產(chǎn)酸量越高；離屯、管組培養(yǎng)是 采用圓底離屯、管均勻排布在離屯、管盒中，組成離屯、管組，各離屯、管中裝入鑒別用種液培養(yǎng) 基，116°C± 2°C滅菌30min，自然冷卻，再分別無菌接入挑取的普通生酬基古龍酸菌單菌落， 然后置于搖床上一同進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于:它通過將經(jīng)誘變處理的普通生酬基古龍酸菌于固體培養(yǎng) 基平板上培養(yǎng)、并在固體培養(yǎng)基中添加一定劑量的指示劑，實(shí)現(xiàn)對普通生酬基古龍酸菌速 生型產(chǎn)酸菌株的簡便、快速鑒別;通過設(shè)計(jì)將挑取的普通生酬基古龍酸菌速生型產(chǎn)酸菌株 接種于種液培養(yǎng)基中培養(yǎng)、并在種液培養(yǎng)基中添加一定劑量的指示劑，實(shí)現(xiàn)對挑取的普通 生酬基古龍酸菌速生型產(chǎn)酸菌株的簡便、快速確認(rèn)，再與離屯、管組培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合，在滿足了 普通生酬基古龍酸菌單菌落接種培養(yǎng)和檢測過程需要獨(dú)立進(jìn)行無菌操作要求的同時(shí)，又取 得了批量培養(yǎng)的效果，從而達(dá)到快速、便捷、準(zhǔn)確、高通量的篩選目的，使普通生酬基古龍酸 菌速生型產(chǎn)酸菌株的選育簡便、快速、高效。
【附圖說明】
[0017] 圖1所示本發(fā)明實(shí)施例1中普通生酬基古龍酸菌菌落在鑒別用固體培養(yǎng)基平板上 生長和菌落周圍培養(yǎng)基顏色的變化情況；
[0018] 圖2所示本發(fā)明實(shí)施例2中普通生酬基古龍酸菌菌落在離屯、管組培養(yǎng)中生長和離 屯、管中鑒別用種液培養(yǎng)基顏色的變化情況。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述，但本發(fā)明的范圍并不僅局限于此，其 要求保護(hù)的范圍記載于權(quán)利要求的權(quán)項(xiàng)中。
[0020] 本發(fā)明實(shí)施例應(yīng)用的培養(yǎng)基如下：
[0021] 鑒別用固體培養(yǎng)基(g/L):山梨糖15、酵母膏3、玉米漿3、蛋白腺8、尿素 l、MgS〇4· 7出0 0.1、KH2P04l、CaC03l、指示劑0.02、瓊脂15，pH7.0~7.5。
[002引鑒別用種液培養(yǎng)基(g/L):山梨糖15、酵母膏3、玉米漿3、蛋白腺10、尿素 l、MgS04· 7出0 0.1、K出P04l、指示劑0.01，pH6.8~7.2。
[0023] (常規(guī)的）種液培養(yǎng)基（g/L):山梨糖15、酵母膏3、玉米漿3、蛋白腺10、尿素1、 MgS04·7出0 0.1、KH2P04l、CaC03 0.5，pH6.8~7.2。
[0024] (常規(guī)的）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):山梨糖80、酵母膏1、玉米漿12、尿素 10、KH2P04 1， MgS04·7出00.1、CaC03 5，pH6.8~7.2。
[002引（常規(guī)的）分離培養(yǎng)基（g/L):山梨糖15、酵母膏3、玉米漿3、蛋白腺8、尿素1、 MgS04·7出0 0.1、KH2P04l、CaC03l、瓊脂20，pH6.8~7.2。
[0026] 實(shí)施例1中，鑒別用固體培養(yǎng)基中加入的指示劑是加有適量漠甲酪紫和甲基紅的 漠百里酪藍(lán)、漠甲酪紫、甲基紅混合物。
[0027] 實(shí)施例2中，鑒別用固體培養(yǎng)基和鑒別用種液培養(yǎng)基中加入的指示劑均是漠百里 酪藍(lán)。
[0028] 實(shí)施例1:普通生酬基古龍酸菌速生型產(chǎn)酸菌株的鑒別及其高產(chǎn)酸性能檢測
[0029] (1)W普通生酬基古龍酸菌化etogulonogenium vulgarum)為出發(fā)菌株進(jìn)行誘變 處理，獲取經(jīng)誘變處理的菌體懸浮液；
[0030] (2)將經(jīng)過誘變處理的菌體懸浮液用無菌蒸饋水逐級(jí)稀釋至10-4,然后吸取0.05~ 0.1 mL均勻涂布于鑒別用固體培養(yǎng)基平板上，31 ± 2°C靜置培養(yǎng)96h，期間自靜置培養(yǎng)4她開 始每隔化觀察一次普通生酬基古龍酸菌菌落生長和菌落周圍培養(yǎng)基顏色的變化情況，標(biāo)記 周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)變色圈的單菌落，編號(hào)原則為變色時(shí)間-菌落序號(hào)，具體的:培養(yǎng)至56h時(shí)有 一株單菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)偏黃色變色圈，標(biāo)記該單菌落編號(hào)為56-1，7化時(shí)有一株單菌落 周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)偏黃色變色圈，標(biāo)記該單菌落編號(hào)為72-1，繼續(xù)培養(yǎng)至96h沒有新的單菌落 周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)偏黃色變色圈，如附圖1所示；
[0031] (3)用無菌牙簽挑取周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)偏黃色變色圈的單菌落，W劃線法轉(zhuǎn)移至分 離培養(yǎng)基平板上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)挑取一株周圍培養(yǎng)基未出現(xiàn)偏黃色變色圈的單菌落作 為對照，同法進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，31±2°C靜置培養(yǎng)4她時(shí)，在各經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)生長出的普通生酬基 古龍酸菌菌苔上分別搭配相同量的巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)，31±2°C繼續(xù)培 養(yǎng)24h取出，得到各普通生酬基古龍酸菌與相同量巨大芽抱桿菌的混合菌斜面；