一種茶樹CsANS啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，設(shè)及一種茶樹兒茶素合成關(guān)鍵基因 CsANS啟動(dòng)子 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 兒茶素類化合物屬于多酪類，是茶葉中最主要的次生代謝產(chǎn)物。兒茶素類物質(zhì)的 合成積累不僅與茶葉品質(zhì)密切相關(guān)，其超強(qiáng)的抗氧化活性，更可作為一種高效、多功能的天 然抗氧化劑和保健藥物，對(duì)人類健康大有禪益。兒茶素的開發(fā)利用及其代謝途徑的深入研 究日益凸顯其重要性，并且引起全世界的關(guān)注。
[0003] 在兒茶素生物合成中，首先利用憐酸戊糖途徑(PPP)中產(chǎn)生的4-香豆酷輔酶A做底 物，開始第一步類黃酬途徑(化途徑)反應(yīng)。查爾酬合成酶(CHS)是該途徑中的第一種酶，在 該酶作用下，1分子4-香豆酷輔酶A和3分子丙二酷輔酶A合成查爾酬，然后在查爾酬異構(gòu)酶 (CHI)和黃燒酬-3-徑化酶(F3H)催化下成為二氨黃酬醇。此后，途徑分為3個(gè)分支，在類黃酬 3'徑化酶(F3'H)、類黃酬3'5'徑化酶(F3'5'H)和二氨黃酬醇還原酶(DFR)作用下生成無色 花色素。無色花色素在無色花色素還原酶(LAR)作用下生成兒茶素，在花青素合成酶(ANS) 作用下生成花色素然后在花色素還原酶(ANR)催化下生成表兒茶素。
[0004] 2013年，科學(xué)家從茶樹中克隆和鑒定了兒茶素合成途徑的關(guān)鍵酶基因 CsLAR， CsANRl和CsANR2,并應(yīng)用于生物工程。但是，由于各種條件的局限性，比如全基因組測(cè)序和 高效率轉(zhuǎn)基因體系的缺乏，國內(nèi)外有關(guān)茶樹類黃酬途徑的分子生物學(xué)研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其 他植物，成果多集中在兒茶素合成酶的克隆和功能鑒定，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面進(jìn)展緩慢。
[0005] 主要的技術(shù)文有：
[0006] Beyfey P N,Chua N Η.,The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinational regulation of transcription in plants [J]. Science,1990,250:959- 966；HoltorfS,ApelK,BohlmannH.Compariso n of different constitutive and inducible promoters forthetrans genes in Arabidopsis thaliana[J].Plant MolBiol,1995,29:637-646；Joshi CP.,An inspection of the dom ain between put ative TATA box and translation startsitein 79plant genes[J].NucleicAcidsRes, 1987,15:6643；Jankun,J.,Selman,S.H.,Swiercz,R.,et al.Why drinking green tea could prevent cancer[J].Nature ,1997,387:561;Lambert,J.D.,and Elias,R.J.The antioxidant and pro-oxidant activities of green tea polyphenols: A role in cancer prevention[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2010,501:65-72; Pang ,Y. ,Abeysinghe, I .S.B. , He ,J. ,et al. Functional characterization of pro曰nthocy曰nidin pathway enzymes from tea and their 曰pplic曰tion for metabolic engineering[J].Plant Physiology,2013,161:1103-1116.;Marles,M.A.S.,Ray,H.,and Gruber,M.Y.New perspectives on proanthocyanidin biochemistry and molecular regulation!!J].Phytochemistry, 2003,64:367-383.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種茶樹花青素合成酶(CsANS) 的啟動(dòng)子。
[0008] 為完成上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] 一種分離的茶樹CsANS的啟動(dòng)子，其序列具有SEQ ID No. 1所述的核巧酸序列，該 啟動(dòng)子序列3'端120bp序列與已知CsANS基因序列（SEQ ID No. 2)上游完全符合，由此初步 推斷克隆得到的序列是CsANS基因的上游調(diào)控序列。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定可靠的茶樹啟動(dòng)子的制備方 法。
[0011] 該方法包括W下步驟：
[001 ^ 步驟（1)、通過TAKARA基因組DNA小量試劑盒提取了茶樹葉片基因組DNA;按照 Genome Walker Universal Kit試劑盒的方法，分別用四種限制性內(nèi)切酶（DraI、ScaI、Pvu Π 和StuI)對(duì)上述基因組DNA進(jìn)行酶切消化，酶切產(chǎn)物(Dkl、化-2、Dk3、化-4)純化回收后 與Genome Wa]_ker Adaptor連接。W上述連接產(chǎn)物為模板，WAPl(Genome Wa]_king kit試劑 盒提供)為上游引物，WGSPl為下游引物進(jìn)行1st PCR;然后W稀釋50倍的第一輪PCR產(chǎn)物為 模板，WAP2(Genome Wa化ing kit試劑盒提供)為上游引物、GPS2為下游引物進(jìn)行2st PCR。 所用引物如下：
[0013] GSP1：GCATTTGGTGAATCATGGGATAGCGG
[0014] GSP2:GGCCACAAGTGCCTACAATTGACT
[0015] 步驟(2)、上述PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，回收目的片段，將化1割膠 回收產(chǎn)物與0.化1 PMD18-T Vector、3.化1 Solution ?；旌虾蠓湃隤CR儀16°C，反應(yīng)12~ 16h，獲得連接液。
[0016] 步驟(3)、上述連接液用凍融法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞后，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布到 含lOOmg/L氨節(jié)青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)過夜，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn) 證陽性的重組子接種于含lOOmg/L氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200r/min震蕩培養(yǎng) 過夜，堿裂解法提取質(zhì)粒，獲得載體CsANSpro/pMDlST，即得到所述的啟動(dòng)子。
[0017] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供兩種含有該啟動(dòng)子的重組載體，該載體在植物體內(nèi)易 于表達(dá)，所帶的標(biāo)記基因表達(dá)強(qiáng)度高，容易檢測(cè)。
[0018] 兩種含有CsANS啟動(dòng)子的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體包 含所述的CsANS啟動(dòng)子。
[0019] (1)擬南芥GUS表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于利用CsANS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)位于其下游 的GUS基因表達(dá)。包括如下步驟:利用BamH巧日Sail雙切CsANSpro/pMDlST和pBIlOl，將酶切 獲得的CsANSpro片段和pBI 101大片段連接，獲得植物表達(dá)載體CsANSpro/pBI 101。將重組質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中。
[0020] (2)煙草瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于選用的載體為雙報(bào)告基因載體 pGreenll 0800-LUC，分別是 REN基因 （Reni 11a Luc if erase)和 LUC 基因 （Firefly Lucif erase)，其中，REN基因由載體自帶的35S啟動(dòng)子進(jìn)行驅(qū)動(dòng)，而LUC基因則由待研究的啟 動(dòng)子進(jìn)行驅(qū)動(dòng)。此載體的優(yōu)點(diǎn)在于REN基因與LUC基因形成了內(nèi)部對(duì)照，最后的報(bào)告基因表 達(dá)活性可用LUC/REN表示。該分析方法被廣泛應(yīng)用于分析轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子的調(diào)控能力，被 成為Dual-LUC方法。包括如下步驟：利用BamH巧日Sail雙切CsANSpro/pMDlST和pGreenll 0800-LUC，將酶切獲得的CsANSpro片段和pGreenll 0800-LUC大片段連接，獲得植物表達(dá)載 體CsANSpro/pGreenll 0800-LUC。
[0021] 另外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得的茶樹ANS啟動(dòng)子序列，通過化ACE數(shù)據(jù)庫，對(duì)比分析。 AtPAPl作為經(jīng)典的黃酬類合成途徑轉(zhuǎn)錄因子，很可能參與CsANS啟動(dòng)子的調(diào)控。AtPAPl與載 體pCambial300連接，構(gòu)建雙元表達(dá)載體。
[0022] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供茶樹CsANS啟動(dòng)子在植物花青素代謝合成途徑中的應(yīng) 用，其特征在于在植物花青素代謝合成途徑中會(huì)直接或間接受到AtPAPl轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。
[0023] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明分離并鑒定了一種茶樹CsANS啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子具有 啟動(dòng)子的基本轉(zhuǎn)錄元件CAAT-box和TATA-box，其中TATA-box元件位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游 25-30bp處，具備了啟動(dòng)子的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，符合真核基因啟動(dòng)子特點(diǎn)。除此之外，目 的序列還包含各種上游啟動(dòng)子元件，如主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率和強(qiáng)度的CAAT框，光反應(yīng)相 關(guān)作用元件，環(huán)境脅迫相關(guān)作用元件，與水楊酸和萊莉酸反應(yīng)相關(guān)的作用元件，胚乳表達(dá)順 式作用元件，與赤霉素、脫落酸相關(guān)的順式作用元件，Mra轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式調(diào)控元件W 及幾種未知功能元件。該啟動(dòng)子在CsANSpro/pBIlOl轉(zhuǎn)基因擬南芥中能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因表 達(dá)，T2代CsANSpro/pBIlOl轉(zhuǎn)基因擬南芥與papl-D(PAPl過量表達(dá)的擬南芥突變體)雜交后， CsANS啟動(dòng)子的活性明顯增強(qiáng)。在煙草dual-LUC系統(tǒng)中，該啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)LUC基因的表達(dá)， 與對(duì)照相比（pCambial300空載體），CsANSpro/pGreenII 0800-LUC與AtPAPl/pCambial300 組合，可大大提CsANS啟動(dòng)子的表達(dá)活性。說明本發(fā)明中克隆得到的茶樹基因啟動(dòng)子在驅(qū)動(dòng) 報(bào)告基因后可在異源體系（擬南芥和煙草）中表達(dá)，且其活性受到轉(zhuǎn)錄因子AtPAPl的調(diào)控， 也就是說，在異源體系中，CsANS的表達(dá)和調(diào)控可部分反應(yīng)在茶樹體內(nèi)真實(shí)情況。由于茶樹 全基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)基因存在巨大困難，克隆茶樹基因啟動(dòng)子和在茶樹體內(nèi)分析基因的調(diào)控 模式，進(jìn)展十分緩慢。運(yùn)是首次從茶樹中分離鑒定到兒茶素合成途徑相關(guān)基因的啟動(dòng)子