伏馬毒素b1核酸適配體鏈置換探針的篩選及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，設及核酸適配體的應用與開發(fā)，具體為伏馬毒素 Bi核 酸適配體鏈置換探針的篩選及應用。
【背景技術】
[0002] 伏馬毒素(fumonisin)是一類主要由串珠鑲刀菌產生的真菌毒素。伏馬毒素主要 存在于玉米及其制品中，此外還存在于大米、小麥、大麥、高梁、魏豆、蘆算、啤酒、牛奶和飼 料等農產品及其加工品中。調查表明：世界各國的玉米及其制品，無論是人食用的食品還是 動物用的飼料，普遍都受到伏馬毒素的污染，其中玉米的污染率達60% W上。目前至少已鑒 定出15種伏馬毒素類似物，其中伏馬毒素 Bi(FBi)的毒性最強。研究證實，伏馬毒素可引起馬 腦白質軟化癥和豬肺水腫綜合癥。世界衛(wèi)生組織國際腫瘤研究中屯、（IARC)于1993年評價了 伏馬毒素的毒性，并將其歸類為可能的人類致癌物；國際食品法典委員會(CAC)的巧CFA最 近的評價結果指出其具有腎臟毒性。農產品中存在的伏馬毒素已成為相關農產品安全消 費、國際貿易和現代農業(yè)產業(yè)發(fā)展的限制因素，對人的健康和畜牧業(yè)發(fā)展構成潛在危害。因 此，研究建立科學先進、準確可靠的伏馬毒素系列監(jiān)控技術，是控制我國農產品伏馬毒素污 染、保障農產品安全消費和人民身體健康的迫切需求。
[0003] 由于伏馬毒素不具有強的紫外吸收和巧光基團，因此不像其它真菌毒素那樣易于 分析檢測?；诳贵w的免疫檢測技術是真菌毒素的主流檢測技術，其中作為快速檢測技術 的巧光偏振檢測技術在國外已經比較成熟，但是其所用的F&巧光標記物如6-(4,6-二氯Ξ 嗦基）氨基巧光素(6-DTAF)相當昂貴，導致檢測成本較高，不利于該技術的大面積推廣應 用。
[0004] 核酸適配體作為一類單鏈寡核巧酸，與祀分子發(fā)生特異性相互作用前后空間構象 會發(fā)生相應的變化，與抗體相比具有可體外篩選獲得、熱穩(wěn)定性好、易于化學合成和修飾等 優(yōu)點，甚至能區(qū)分單抗無法實現的單個取代基差別的祀分子。2010年，Maureen McKeague報 道了伏馬毒素 Bi 的核酸適配體（Int.J. Mol. Sci. 2010，11:4864-4881 ;doi : 10.3390/ i加 S11124864)，但是針對該核酸適配體的相關應用報道較少。
[0005] 針對我國農產品質量安全檢測的需求，充分利用巧光偏振檢測技術和核酸適配體 技術的優(yōu)勢，本發(fā)明公開了 FBi核酸適配體鏈置換探針的篩選，并開發(fā)了基于該鏈置換探針 的FBi巧光偏振檢測技術，有助于建立適合我國國情的農產品伏馬毒素監(jiān)控技術體系，滿足 當前我國對農產品伏馬毒素污染監(jiān)控關鍵技術的迫切需要，對保障農產品消費安全和人民 生命健康意義重大，應用前景廣闊。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種伏馬毒素 Bi核酸適配體的鏈置換探針，并提供基于該 鏈置換探針的伏馬毒素 Bi巧光偏振檢測方法，具有特異性高、穩(wěn)定性好、經濟的特點。
[0007] 為實現上述目的本發(fā)明采用W下技術方案：
[0008] 一種伏馬毒素 Bi核酸適配體鏈置換探針，所述置換探針為一段單鏈寡核巧酸，其 序列如SEQ ID N0:1。
[0009] 所述探針5'端修飾有FAM巧光基團。
[0010] 所述探針與伏馬毒素 Bi核酸適配體互補。
[00川所述伏馬毒素 Bi核酸適配體序列如沈Q ID NO:6所示。
[0012] 所述伏馬毒素 Bi核酸適配體鏈置換探針是通過巧光光譜法和巧光偏振法篩選的。
[0013] 伏馬毒素 Bi核酸適配體鏈置換探針作為玉米和小麥中伏馬毒素 Bi的巧光偏振檢測 分析應用。
[0014] 本發(fā)明的有益效果：
[0015] (1)本發(fā)明公開了 FBi核酸適配體鏈置換探針的篩選，為后續(xù)基于FBi核酸適配體鏈 置換探針的信號放大傳感技術研發(fā)奠定了基礎。
[0016] (2)本發(fā)明開發(fā)的基于該鏈置換探針的FBi巧光偏振檢測技術采用FBi核酸適配體 作為分子識別元件，與基于抗體的免疫檢測技術相比，具有非常好的特異性；同時，因核酸 的合成成本非常低廉，且已經商業(yè)化，大大降低了檢測FBi的成本。
[0017] (3)本發(fā)明公開的基于該鏈置換探針的FBi巧光偏振檢測技術為均相檢測技術，重 現性好，且操作簡單方便且可實現大量樣品的平行檢測，有助于建立適合我國國情的農產 品伏馬毒素監(jiān)控技術體系，滿足當前我國對農產品伏馬毒素污染監(jiān)控關鍵技術的迫切需 要，對保障農產品消費安全和人民生命健康意義重大，應用前景廣闊。
【附圖說明】
[0018] 圖1為鏈置換探針篩選圖；
[0019] 圖2為鏈置換探針優(yōu)化篩選圖；
[0020] 圖3為巧光光譜法評價FBi核酸適配體鏈置換探針的活性；
[0021 ]圖4為巧光偏振法評價FBi核酸適配體鏈置換探針的活性；
[0022] 圖5為標準工作曲線。
【具體實施方式】：
[0023] -種伏馬毒素 Bi核酸適配體鏈置換探針，所述置換探針為一段單鏈寡核巧酸，其 序列如沈Q ID NO: 1所示。
[0024] 所述探針5'端修飾有FAM巧光基團。
[0025] 所述探針與伏馬毒素 Bi核酸適配體互補。
[0026] 所述伏馬毒素 Bi核酸適配體序列如SEQ ID NO:6所示。
[0027] 所述伏馬毒素 Bi核酸適配體鏈置換探針是通過巧光光譜法和巧光偏振法篩選的。
[0028] 伏馬毒素 Bi核酸適配體鏈置換探針作為玉米和小麥中伏馬毒素 Bi的巧光偏振檢測 分析應用。
[0029] W下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明，具體步驟如下：
[0030] 本發(fā)明中所用的。81核酸適配體序列為2010年1曰11'66111沈6曰邑116報道的。81核酸適 配體其序列如SEQ ID N0:6所示。與該核酸適配體互補的單鏈寡核巧酸序列的設計原則為： 一方面要保證室溫條件下雜交復合物不能解鏈;另一方面要保證FBi與核酸適配體結合時， 能將巧光基團修飾的單鏈寡核巧酸片段競爭下來。
[0031 ] 利用生物學在線計算軟件化ttp: //unafold. rna. a化any. edu/)，在1 X反應緩沖 溶液條件下，溫度參數設為37°C，DNA濃度設置為O.luM，計算單鏈寡核巧酸片段與核酸適配 體雜交的融鏈溫度Tm，要求25°C含化含60°C。實驗中所設計的所有單鏈寡核巧酸片段如表1 所示，5'端均修飾有FAM巧光基團；FBi核酸適配體及其他巧光修飾探針均由上海生工公司 合成;FBi購于PRIB0LAB公司，磁性納米粒子(直徑Ιμπι)購于鄭州英諾生物科技有限公司。
[0032] 表1實驗中所設計的單鏈寡核巧酸片段
[0033]
[0034] *:Tm計算利用在線軟件ht1:p://unafold.rna.a化any.edu/，參數設置：DNAat 37 °C，[DM] = le-7M，[Na+] = 0.105M，[Mg2+] = 0.003M。
[0035] IX反應緩沖溶液溶解的FBi核酸適配體儲備液用之前經95°C5min，冰水浴5min處 理。首先將FBi核酸適配體與巧光素修飾的鏈置換探針雜交形成雜交復合物，然后利用親和 素-生物素相互作用將該復合物組裝到磁性納米粒子表面。充分洗涂后用50nM的FBi標準溶 液