質(zhì)的調(diào)節(jié)主要由于該片段對(duì)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量的正向調(diào)控;該片段從 擬南芥中獲得，包含提高馬鈴馨莖塊抗氧化能力基因 CQAIP1，本發(fā)明提供了該片段的分離 克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用的具體方法;本發(fā)明利用馬鈴馨莖塊特異性表達(dá)啟動(dòng)子化tatin-2， 驅(qū)動(dòng)CQAIP1在馬鈴馨莖塊中特異表達(dá)，大大提高了馬鈴馨莖塊中四種單咖啡酷奎尼酸及兩 種黃酬醇類黃酬醇類Ξ糖含量在此基礎(chǔ)上大大提高了馬鈴馨莖塊的抗氧化能力，驗(yàn)證了擬 南芥CQAIP1基因具有提高馬鈴馨莖塊抗氧化能力的功能，并通過(guò)上調(diào)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因 表達(dá)量達(dá)到提高上述兩種黃酬醇類Ξ糖含量的作用；同時(shí)建立在此基礎(chǔ)上，W栽培型馬鈴 馨作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)四種單咖啡酷奎尼酸及黃酬醇類黃酬醇類Ξ糖生物制品，實(shí)行產(chǎn)業(yè) 化;也可W此獲得馬鈴馨的工程細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)方式生產(chǎn)多種單咖啡酷奎尼酸及上述 兩種黃酬醇類Ξ糖。同時(shí)本發(fā)明馬鈴馨中使用的轉(zhuǎn)化載體可W通過(guò)雌二醇的誘導(dǎo)作用剔除 篩選標(biāo)記，得到具有食用安全性的抗氧化馬鈴馨品種，進(jìn)行品種培育。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1所示為本發(fā)明的抗氧化轉(zhuǎn)基因馬鈴馨生產(chǎn)流程示意圖； 圖2為實(shí)施例1中化化tin-2啟動(dòng)子和CQAIP1基因 PCR擴(kuò)增后電泳圖， 圖2a中Μ為TaKaRa DNA Marker DL 2,000，1為CQAIP1基因，N為陰性對(duì)照， 圖化中Μ為TaKaRa DM Marker DL 2,000,1為化化tin-2啟動(dòng)子，N為陰性對(duì)照； 圖3所示為實(shí)施例1中中間載體pBS-Patatin-2: CQAIPl酶切后電泳圖，其中Μ為 Trans2K? Plus DNA Marker; 1-3分別為化〇 I /EcoR I，EcoR I/Spe I，Xho I/Spe I 雙酶切結(jié)果;4為地S空載體陰性化o I/Spe I酶切對(duì)照； 圖4所示為實(shí)施例1中重組質(zhì)粒pX6-化tatin-2: : CQAIPl的酶切后電泳圖，其中Μ為 Trans2K? Plus II DNA Marker; 1-3為重組質(zhì)粒pX6-Patatin-2 ::CQAIP1 化〇1 /Spe I 雙酶切結(jié)果； 圖5所示為實(shí)施例2馬鈴馨遺傳轉(zhuǎn)化不同時(shí)期生長(zhǎng)狀況，其中A為愈傷組織誘導(dǎo)后;B為 分化產(chǎn)生不定芽時(shí);C為再生苗生根;D，E為轉(zhuǎn)基因再生馬鈴馨苗;F為苗移栽大田后植株； 圖6所示為實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因植株中目的基因 CQAIP1的PCR檢測(cè)結(jié)果，其中Μ為TaKaRa DNA Marker DL 2,000,1為陰性對(duì)照，2-11為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株； 圖7所示為野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因莖塊(CQAIP1)提取液HPLC分析結(jié)果，其中S1為3-咖啡 酷奎尼酸，S2為1-咖啡酷奎尼酸，S3為5-咖啡酷奎尼酸，S4為4-咖啡酷奎尼酸（綠原酸），S5 為搬皮素-葡萄糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧，S6為山糞酪-葡萄糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧； 圖8所示為野生型(WT)和Ξ個(gè)不同轉(zhuǎn)基因 Τι代株系莖塊(CQAIPl-l，CQAIPl-2，CQAIPl- 3) 葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)圖； 圖9所示為野生型(WT)和Ξ個(gè)不同轉(zhuǎn)基因 Τι代株系莖塊(CQAIPl-l，CQAIPl-2，CQAIPl- 3) 提取液抗氧化能力分析結(jié)果。
[0016]
【具體實(shí)施方式】： 為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實(shí)例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0017] 本發(fā)明中所設(shè)及的多種培養(yǎng)基具體如下： MS培養(yǎng)基：100 mL 10XMSmax，10 mL 100XMSmin，10 mL 100XFe2-EDTA，10 mL 100 X化tato Vi化min,30 g薦糖，氨氧化鐘或鹽酸調(diào)抑至5.7-5.8,定容至1 L。若為MS固體培 養(yǎng)基，加入0.8%瓊脂粉。
[001 引 共培養(yǎng)培養(yǎng)基 M0:1XMS，薦糖20 g/L，NAA 0.2 mg/L，GA3 0.02 mg/L，zeatin riboside2.5mg/L，瓊脂粉8g/L，p冊(cè).7-5.8。
[0019] 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基 M1:M0 + cefo化xime 500 mg/L。
[0020] 分化培養(yǎng)基 M2:MS + NAA 0.02 mg/L, GA3 0.02 mg/，zeatin riboside 2 mg/ L, cefotaxime 500 mg/L, kanamycin 50 mg/L。
[0021 ]生根培養(yǎng)基M2R:MS + cefotaxime 500 mg/L,kanamycin 25 mg/L，瓊脂粉8 g/L， p服.7-5.8。
[0022] 實(shí)施例1 莖塊特異性化化tin-2啟動(dòng)子基因全長(zhǎng)DNA和CQAIPl基因全長(zhǎng)cDNA的克隆，植物表達(dá)載 體的構(gòu)建： 1. 馬鈴馨莖塊特異性化化ti-2啟動(dòng)子基因 DM和CQAIPl基因 cDNA的克隆 W擬南芥Col-1來(lái)源的cDNA為模板，利用引物CQAIP1 F1，其基因序列如如SEQ ID N0:2 所示，和CQAIPl Rl，其基因序列如如SEQ ID N0:3所示，擴(kuò)增出預(yù)期1.化b片段（如說(shuō)明書(shū) 附圖圖2所示）dPCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)化〇1和EcoRI對(duì)其進(jìn)行雙酶切并連接到pBS-XhoI-EcoRI- cut載體上，形成過(guò)渡載體地S-CQAIP1。
[002引 W馬鈴馨中馨4號(hào)DNA為模板，引物化化tin-2 F1，其基因序列如如SEQ ID N0:4所 示，和化tatin-2 R1，其基因序列如如SEQ ID N0:5所示，組合擴(kuò)增，得到預(yù)期1.5化片段 (如說(shuō)明書(shū)附圖圖2所示）。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Spe I和EcoR I雙酶切處理，并連接入Spel和 EcoRI雙酶切處理的過(guò)渡載體pBS-CQAIPl，生成新的過(guò)渡載體pBS-Patatin-2: : CQAIP1。對(duì) 過(guò)渡載體使用趾01 /EcoR I，EcoR I/Spe I，化0 I/Spe I酶切驗(yàn)證，確認(rèn)其攜帶目標(biāo)片 段(說(shuō)明書(shū)附圖圖3所示）。進(jìn)一步采用雙酶切和連接策略，通過(guò)趾01和Spel雙酶切將上述過(guò) 渡載體中組裝完成的化化tin-2: :CQAIP1片段置換植物表達(dá)載體PX6-GFP中趾ol-Spe I區(qū) 間的片段，完成載體9乂6-化*曰^11-2::〔941?1的構(gòu)建，對(duì)載體使用化01/590 1酶切驗(yàn)證，確 認(rèn)其攜帶目標(biāo)片段(說(shuō)明書(shū)附圖圖4所示）。
[0024]試驗(yàn)中用到的引物序列及說(shuō)明如表1所示： 表1
2. 植物表達(dá)載體陰6-Patatin-2: : CQAIP1的構(gòu)建 將克隆到的CQAIP1序列片段，經(jīng)化〇1和EcoRI雙酶切后電泳回收，并與相同酶切回收的 過(guò)渡載體地S連接，形成過(guò)渡載體地S-CQAIP1。
[00巧]將克隆到的化tatin-2啟動(dòng)子片段，進(jìn)行Spel和EcoRI雙酶切處理，并連接入Spel 和EcoRI雙酶切處理的過(guò)渡載體地S-CQAIP1，生成新的過(guò)渡載體地S-Patatin-2: : CQAIP1。 對(duì)過(guò)渡載體使用趾〇1 /EcoR I，EcoR I/Spe I，Xho I/Spe I雙酶切后電泳檢測(cè)，重組子 酶切結(jié)果中均含有目標(biāo)片段，表明過(guò)渡載體地S-化tatin-2: : CQAIP1構(gòu)建成功(如說(shuō)明書(shū) 附圖圖3)。進(jìn)一步采用雙酶切和連接策略，通過(guò)化〇1和Spel雙酶切將上述過(guò)渡載體中組裝 完成的化tatin-2: :CQAIP1片段置換植物表達(dá)載體PX6-GFP中Miol-Spel區(qū)間的片段，完成 載體pX6-化tatin-2: :CQAIP1的構(gòu)建，對(duì)載體使用趾〇1 /Spe I酶切驗(yàn)證，確認(rèn)其攜帶目標(biāo) 片段（如說(shuō)明書(shū)附圖圖4)。該重組載體經(jīng)測(cè)序重復(fù)驗(yàn)證后導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株AGL1并進(jìn)行馬鈴 馨遺傳轉(zhuǎn)化。
[0026] 實(shí)施例2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴馨遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè) 1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴馨遺傳轉(zhuǎn)化 利用馬鈴馨莖段為外植體，采用農(nóng)桿菌(AGL1菌株)介導(dǎo)的莖段轉(zhuǎn)化法，將植物表達(dá)載 體pX6-F*atatin-2: :CQAIP1轉(zhuǎn)化Desiree受體材料。一切操作均在嚴(yán)格的無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行， 轉(zhuǎn)基因操作基本程序如下： 1)選擇生長(zhǎng)到3到4周，健壯的馬鈴馨無(wú)菌苗，剪取無(wú)莖節(jié)莖段(長(zhǎng)約0.5-0.8cm)。放置 于農(nóng)桿菌懸浮液中，每20