一種酯酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明克隆表達(dá)了一種醋酶，并公開了其核巧酸序列和氨基酸序列及酶學(xué)性質(zhì)和 應(yīng)用，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿魏酸醋酶(Feruloyl esterases，F(xiàn)AEs)又稱肉桂酸醋酶，它是一種簇酸醋酶，是 能水解阿魏酸甲醋、低聚糖醋酶和多糖阿魏酸醋中的醋鍵，釋放游離阿魏酸的酶。它能切斷 細(xì)胞壁中多糖-多糖、多糖-木質(zhì)素間的交聯(lián)，有利于細(xì)胞壁物質(zhì)中多糖的降解和木質(zhì)素的 釋放，因此在食品、飼料和造紙工業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。在食品工業(yè)中，利用醋酶來降解 植物細(xì)胞壁中的阿魏酸醋鍵，可W得到有藥用價(jià)值和保健功能的游離阿魏酸。而植物性原 材料通過醋酶的處理細(xì)胞壁變得疏松，作為飼料工業(yè)的原料更容易被禽畜消化利用，作為 制漿造紙工業(yè)的原料可W減少制漿工序化化學(xué)藥品的使用，減少污染，并有利于后續(xù)工序 的進(jìn)行。
[0003] 1987年，阿魏酸醋酶在Str邱tomyces olivoc虹omogenes中被第一次發(fā)現(xiàn)。研究表 明真菌、細(xì)菌、酵母都能分泌醋酶，目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)酶微生物有黑曲霉（Aaspergillus niger)，鏈霉菌（Streptomyces avermitilis)，梭菌（Clostridium thermocellum)，乳酉《桿 菌(Xactobacilli sp.)，假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)等，但絕大多數(shù)醋酶是從真 菌中分離出來。研究發(fā)現(xiàn)約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)有較強(qiáng)的阿酸醋酶活性， 并且已經(jīng)從中克隆表達(dá)出2個(gè)阿魏酸醋酶的基因 （Biochemical Properties of Two Cinn曰moyl Esterases Purified from 曰 L曰ctob曰cillus johnsonii Str曰in Isol曰ted from Stool Samples of Diabetes-Resistant Rats,Applied and environmental microbiology,2009,75(15) ,5018-5024)。通過對約氏乳桿菌的特性研究，該菌可能還有其 它的醋酶。本專利公開了一種新型的約氏乳桿菌醋酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明從約氏乳桿菌中克隆得到了一個(gè)新型的醋酶基因，利用大腸桿菌工程菌異 源表達(dá)，公開了其相關(guān)的酶學(xué)特性。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 1、菌株
[0007] 本發(fā)明醋酶基因的來源菌株為：Lactobacillus johnsonii ATCC11506(從美國 ATCC菌種庫購買）。
[000引 2、醋酶基因的克隆
[0009] 提取Lactobacillus johnsonii ATCC11506菌體基因組總DNA。設(shè)計(jì)特異性引物， 應(yīng)用PCR方法，擴(kuò)增出醋酶基因全長編碼框序列。并構(gòu)建重組質(zhì)粒。
[0010] 3、醋酶表達(dá)與純化
[0011] 將重組質(zhì)粒導(dǎo)入化21大腸桿菌中，誘導(dǎo)表達(dá)。菌體破碎后得到粗酶液，再純化后冷 凍干燥備用。
[0012] 4、醋酶酶學(xué)性質(zhì)
[0013] W阿魏酸甲醋為底物研究pH對本發(fā)明所述醋酶酶活的影響。
[0014] W阿魏酸甲醋為底物研究溫度對本發(fā)明所述醋酶酶活的影響。
[001 引 W 阿魏酸甲醋為底物測定了 Fe2\Ag+Je3\K\Ca2\Cu2+、Mg 2\Mn2\Zn2+、Ba2+離子 對酶活的影響。
[0016]醋酶的底物特性分析:所用的底物有己酸乙醋、葵酸乙醋、下酸乙醋、辛酸乙醋、乙 酸乙醋、乙締葵酸醋、己豆酸乙締醋、月桂酸乙締醋、Ξ甲基乙酸乙締醋、苯甲酸乙締醋、甲 基丙締酸乙締醋、丙酸乙締醋、正下酸乙締醋、乙酸乙締醋、甘油Ξ下醋、丫-戊內(nèi)醋、乙酸下 醋、Ξ-0-乙酷基-D葡萄締糖、Ξ乙酸甘油醋、a-D( + )五乙酷葡萄糖、乙酸香葉醋、乙酸正丙 醋、乙酸異丙締醋、乳酸甲醋、二氨萊莉酬酸甲醋、辛酸甲醋、己酸甲醋、2-漠丙酸甲醋、漠乙 酸甲醋、甲基(R)-(-)-扁桃酸、漠苯乙酸甲醋、肉桂酸卞醋、乙酸-2-糞醋、丙酸糞醋、乙酸苯 醋、下酸糞基醋、4-硝基苯基辛酸醋、乙酸-1-糞醋、2,6-二徑基-4-甲基苯甲酸甲醋、糞酪丙 酸醋、甲基扁桃酸醋、阿魏酸乙醋、阿魏酸甲醋、綠原酸、迷迭香酸、咖啡酸乙醋、咖啡酸苯乙 醋、對徑基肉桂酸甲醋。
[0017] 酶活測定方法為:4ml反應(yīng)體系，包含3ml憐酸緩沖液(0.02mol · ，抑6.0)，lml 底物溶液(4mg/ml底物），加 g冷凍干燥的酶，35°C反應(yīng)4h，高溫100°C加熱終止反應(yīng)。用高效 液相色譜檢測底物減少量，高效液相色譜檢測條件為:〇-15min 10%乙臘，90%水(0.1 %甲 酸）；15-20min 100%乙臘，0水；20-30min 10%乙臘，90%水（0.1%甲酸），檢測器為 Alltech 3300型蒸發(fā)光散射檢測器。溫度、pH、離子、底物的影響均采用該體系。
[0018] 5. W去淀粉教皮為原料，添加該醋酶后的阿魏酸釋放率分析。
[0019]去淀粉教皮按照文獻(xiàn)的方法制備（Xylan-hydrolysing enzymes from Streptomyces spp.Enzyme and Microbial Technology, 1988,10(7):403-409.)。教皮中 阿魏酸的總量W堿法提取得到的阿魏酸計(jì)算（Preparation of ferulic acid from agricultural wastes: Its improved extraction and purification. Journal of Ag;ricul1:ural and Food 化emistry，2008,56(17) :7644-7648.)。阿魏酸釋放率為阿魏酸 的酶解釋放量占堿提取的阿魏酸總量的百分率
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 本實(shí)施例為本發(fā)明所述醋酶基因的克隆與表達(dá)。
[0022] 1'Lactobacillus johnsonii ATCC1150抓NA的提取
[0023] 將Lactobacillus johnsonii ATCC11506菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng) 12小時(shí)，12000r/ min離屯、10分鐘得到菌體，應(yīng)用細(xì)菌基因組DM抽提試劑盒(TaKaRa公司）按照其操作提取 Lactobacillus johnsonii ATCC11506菌體基因組總DNA，放冰箱備用。
[0024] 2、大腸桿菌感受態(tài)制備
[0025] (1)接種E.coli D冊α和化21(DE3)分別于含有20mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37 °C、200巧m/min培養(yǎng)過夜。
[0026] (2)按1%接種量接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600約0.6(約2~化）。
[0027] (3)將菌液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的離屯、管中，冰上放置30min，8000;rpm/min、4°C離屯、 5min。
[0028] (4)棄上清，加入5mL預(yù)冷的O.lmol/L CaC12溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min， 8000巧 m/min、4°C 離屯、5min。重復(fù) 2次。
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