一種人類(lèi)金屬硫蛋白-3融合蛋白表達(dá)載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，設(shè)及一種人類(lèi)金屬硫蛋白-3融合蛋白表達(dá) 載體，尤其是設(shè)及一種具有伴侶樣蛋白功能的人類(lèi)游離脂肪酸結(jié)合蛋白與人類(lèi)金屬硫蛋白 的融合表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] 1957年Margoshes和Vallee在研究金屬生物學(xué)作用時(shí)，從動(dòng)物器官分離出一種新 的蛋白質(zhì)，它含有豐富的琉基，能馨合大量的金屬離子，此物質(zhì)稱(chēng)為金屬硫蛋白（英文為 Me1:allothionein，簡(jiǎn)稱(chēng)MT)。
[0003] 關(guān)于金屬硫蛋白，全球從1978年到1999年，先后在瑞±、日本、美國(guó)共舉行了四次 國(guó)際專(zhuān)題研討會(huì)，第五次國(guó)際專(zhuān)題研討會(huì)于2005年10月在北京召開(kāi)。1987年我國(guó)將MT列入 [863]計(jì)劃/'八五"、"九五"重大攻關(guān)項(xiàng)目，1994年列入國(guó)家級(jí)[火炬計(jì)劃];2003年MT項(xiàng)目被 國(guó)家科技部列為"國(guó)家科技成果重點(diǎn)推廣計(jì)劃項(xiàng)目，1995年聯(lián)合國(guó)將MT列入向世界各國(guó)推 薦的生物技術(shù)產(chǎn)品。由此可見(jiàn)從國(guó)內(nèi)到國(guó)外對(duì)MT的研究、開(kāi)發(fā)、推廣、應(yīng)用的高度重視。
[0004] 金屬硫蛋白（Metallothionein，MT)，又稱(chēng)琉基金屬結(jié)合蛋白。一類(lèi)非酶蛋白質(zhì)，除 含有儒(Cd)、鋒(Zn)的MT外，在自然界也存在含有銅(Cu)、隸化）、金(Au)、祕(mì)(Bi)等元素的 MTdMT的蛋白分子內(nèi)不含有芳香族氨基酸和組氨酸。讓MT中50%的金屬離子發(fā)生解離的pH 值分別為：Zn-MT: 3.5~4.5 ; Cd-MT: 2.5~3.5 ; Cu-MKl. 0。因 MT缺乏芳香族氨基酸，故在 28化m處無(wú)吸收峰，然而具有與金屬相關(guān)的吸收峰。去金屬的MT在190nm處有一個(gè)吸收峰。所 有脊椎動(dòng)物、多數(shù)植物和微生物體內(nèi)都含有MT。無(wú)論是自然產(chǎn)生還是誘導(dǎo)產(chǎn)生的MT，其氨基 酸組成基本相同、主要不同在所含金屬及其含量。
[0005] 人類(lèi)MT按分子特征和分布分為四個(gè)亞群:]\0'1、]\0'2、]\?'3、]\?'4。]\0'1又分9個(gè)亞類(lèi)，]\?'2 又分MT2a和MT2bDMTl和MT2分布全身，MT3分布于腦，MT4主要分布于皮膚。
[0006] 自由基是人體衰老的第一大元兇，自由基還與人類(lèi)若干中老年疾病緊密相關(guān)，導(dǎo) 致人體免疫力逐步下降，MT是目前已知的最好的自由基清除劑，減少自由基就能延緩人體 衰老步伐。同時(shí)，MT也是目前唯一有效的重金屬解毒和清除蛋白。人體重金屬超標(biāo)或中毒， 損害肝、腎、骨、腦和記憶功能，引發(fā)多種疾病。
[0007] 大量的科學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床結(jié)果表明：MT在抗電離福射、紫外線照射、解除金屬毒素、 治療或緩解消化道潰瘍、屯、肌梗塞、各種炎癥、各種癌癥、保護(hù)皮膚、減輕吸煙及環(huán)境污染對(duì) 人體的危害及抗過(guò)敏等方面均有顯著療效。
[000引目前MT產(chǎn)品主要從兔肝、馬腎、豬肝和微生物(如粗脈抱菌)等中提取，成本高、產(chǎn) 量低，抑制了她的廣泛使用，比如食品、飲品、化妝品等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種人類(lèi)金屬硫蛋白融合蛋白表達(dá)載體。
[0010] 本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0011] -種人類(lèi)金屬硫蛋白融合蛋白表達(dá)載體，所述的人類(lèi)金屬硫蛋白融合蛋白表達(dá)載 體是將人類(lèi)金屬硫蛋白-3(MT3)的編碼序列作為目標(biāo)蛋白編碼序列插入伴侶樣蛋白的融合 蛋白表達(dá)載體的多克隆區(qū)所得;所述的伴侶樣蛋白的融合蛋白表達(dá)載體上游含有人類(lèi)游離 脂肪酸結(jié)合蛋白-6的編碼序列，人類(lèi)游離脂肪酸結(jié)合蛋白編碼序列下游包含一段柔性接頭 區(qū)和用于插入目標(biāo)蛋白的多克隆區(qū)。
[0012] 所述的人類(lèi)游離脂肪酸結(jié)合蛋白-6與人類(lèi)天然游離脂肪酸結(jié)合蛋白的同源性等 于或大于85%，所述的人類(lèi)游離脂肪酸結(jié)合蛋白-6的編碼序列優(yōu)選為經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的編 碼序列。
[0013] 所述的人類(lèi)游離脂肪酸結(jié)合蛋白-6的編碼序列優(yōu)選如SEQ ID NO. 1所示。
[0014] 所述的柔性接頭區(qū)和多克隆區(qū)序列優(yōu)選如SEQ ID NO.3所示。
[0015] 所述的人類(lèi)金屬硫蛋白-3其氨基酸序列優(yōu)選與人類(lèi)天然金屬硫蛋白的氨基酸序 列的同源性等于或大于75%。
[0016] 人類(lèi)金屬硫蛋白-3(MT3)氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，經(jīng)密碼子優(yōu)化的人類(lèi) 金屬硫蛋白-3(1了3)編碼序列優(yōu)選如56〇10^.20所示。
[0017] 所述的表達(dá)載體中人類(lèi)游離脂肪酸結(jié)合蛋白-6的編碼序列的上游還包含編碼用 于分離純化融合蛋白的標(biāo)簽的序列，優(yōu)選編碼組氨酸標(biāo)簽的序列。
[001引有益效果：
[0019] 1.本發(fā)明構(gòu)建的重組表達(dá)載體能夠促進(jìn)或誘導(dǎo)被融合的下游人類(lèi)金屬硫蛋白融 合蛋白的折疊，具有蛋白伴侶樣蛋白的特性。
[0020] 2.該FABP蛋白為人源性，理論上不存在對(duì)人體的免疫原性，適于制藥工業(yè)中解決 目標(biāo)蛋白包涵體問(wèn)題，并且可W保留融合蛋白一同制藥。
【附圖說(shuō)明】
[0021 ]圖1、hFABP融合蛋白示意圖
[0022] 圖2、祀T28a-hFABP6表達(dá)載體物理圖
[0023] 圖3、祀T28-hFABP6-MT3環(huán)狀質(zhì)粒物理圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用進(jìn)行說(shuō)明，所舉的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明的應(yīng) 用作概括性例示，有助于更好地理解本發(fā)明的用途，但并不會(huì)限制本發(fā)明應(yīng)用范圍。下述實(shí) 施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法;所述試劑和材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可 從商業(yè)途徑獲得。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] -種伴侶樣蛋白的融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括W下步驟：
[0027] 步驟一、hFABP的編碼DNA的人工合成和優(yōu)化，本實(shí)施例WhFABP6為例：
[002引 （1)取hFBP6氨基酸序列（SEQ ID ^.2)逆向翻譯成0魁編碼序列，經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)先 性、核糖體結(jié)合區(qū)序列優(yōu)化獲得序列（SEQ ID NO.1)，但不限于此序列，W翻譯后的蛋白質(zhì) 氨基酸序列同源性等于或大于85 %為限。
[0029] (2)將該編碼序列分段合成寡核巧酸單鏈DNA(SEQ ID NO.5~18)。
[0030] (3)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法合成全長(zhǎng)編碼DM序列，包含5'-6xHisTag(SEQ ID NO.4)、hFBP6氨基酸編碼序列、3'-柔性接頭序列化inker)和多克隆區(qū)（SEQ ID NO.3)。
[0031] (4)經(jīng)測(cè)序反應(yīng)驗(yàn)證全長(zhǎng)DM序列（SEQ ID NO. 19所示）。
[0032] 步驟二、載體制備：
[0033] (1)將步驟一合成得到的hFABP6編碼序列（SEQ ID N0.19)，包含5'-6址isTag、3'- 柔性接頭序列化inker)和多克隆區(qū)，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切消化、瓊脂糖凝膠純化，獲得兩端 分別是化0 I和化0 I的粘性接頭的插入片段。
[0034] (2)制備表達(dá)載體祀T28a，但不限于該表達(dá)載體：
[0035] ①取祀T28a載體化g，用限制性?xún)?nèi)切酶化0 I和趾0 I雙酶切。
[0036] ②瓊脂糖凝膠電泳分離、純化線性化后的祀T28a載體。
[0037] ③用T4DNA連接酶將包含hFABP6序列的插入片段和步驟②制備好的祀T28a表達(dá)載 體連接。
[0038] ④轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)菌株D冊(cè)α，含卡那霉素化an)抗生素的培養(yǎng)皿培養(yǎng)過(guò)夜，然 后挑取單菌落，PCR法鑒定陽(yáng)性克隆，常規(guī)制備DNA質(zhì)粒。
[0039] ⑤將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送交DNA序列分析，選取和保留正確序列的克隆供表達(dá)測(cè)試。
[0040] ⑥載體命名為祀T28a-hFABP6(SEQ ID N0.22)
[0041 ] 步驟Ξ、載體的表達(dá)測(cè)試：
[0042] (1)將步驟二得到的祀T28a-hFABP6載體DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌化2UDE3)感受態(tài) 細(xì)胞，獲得Kan抗性的菌落。
[0043] (2)挑取單菌落數(shù)個(gè)，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)4-12小時(shí)，收集菌液ImL，離屯、收集 菌體，