一種同時完成基因位點、染色體及連鎖分析的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及基因組序列分析領域和生物信息學領域，具體設及一種利用MALBAC擴 增技術結合高通量測序，一步完成單細胞單基因疾病、染色體疾病及連鎖分析的方法。
【背景技術】
[0002] 遺傳疾病是指人體中的遺傳物質(染色體或者線粒體DNA上的基因序列)發(fā)生改變 而引起的疾病，近年來遺傳病的發(fā)病率逐年增高。在我國，每年有多達數(shù)萬例染色體異常的 患兒出生，染色體異?；純褐两袢詿o法治愈。而目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的單基因遺傳疾病有7000多 種，其中已經(jīng)明確致病基因的有4000多種，雖然單基因遺傳病的單個病種發(fā)病率較低，但由 于其種類繁多，所W在出生活嬰中的總體發(fā)病率和人群中的總體患病率并不低，并且大部 分單基因遺傳病具有致死性、致殘性或致崎性，除少部分可W通過某些治療手段進行校正 夕h大部分至今尚無有效的治療手段。解決上述問題的根本途徑就是進行出生前或胚胎移 植前診斷，避免此類患兒的出生，因此，胚胎著床前遺傳診斷對預防單基因遺傳病及染色體 遺傳病的發(fā)生和傳遞具有重要的科學及社會意義。
[0003] 遺傳病的胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)是生殖醫(yī)學重要內容，可W阻斷在胚胎著 床前，避免患兒出生，從而避免和減少遺傳病的發(fā)生，減輕家庭和社會的經(jīng)濟負擔。目前，胚 胎著床前遺傳學診斷主要采用FISH和單細胞PCR技術，W及近幾年應用到臨床PGD的CGH array和SNP array技術。其中，應用FISH進行胚胎篩選受到探針的限制，不能同時檢測所有 染色體狀態(tài);單細胞固定易導致信號丟失，單細胞PCR技術易造成等位基因脫扣(ADO)，從而 引起誤診;CGH array只能診斷染色體數(shù)目改變及大片段染色體結構(非平衡易位，重復、缺 失），而SNP array雖能進行所有CGH能診斷的染色體異常，分辨率較CGH提高，但不能同時完 成單基因遺傳病和染色體疾病的診斷。可見，現(xiàn)有的胚胎植入前遺傳學診斷技術仍存在各 種不足，無法滿足實際需求，在使用和推廣上均受到一定的限制。
[0004] 此外，連鎖分析方法現(xiàn)有的主要是采用STR和SNP兩種遺傳標記。多重巧光PCR技術 將多重PCR結合巧光探針檢測STR分型，由于STR連鎖標記較少，應用到具體案例中可能會沒 有可用STR位點，所W進行臨床檢測前需要做大量預實驗工作，STR遺傳標記大多距離致病 位點距離較遠，易發(fā)生染色體重組導致誤診，且檢測成本較高，故此技術無法進行批量檢 測。而忍片和探針捕獲SNP的方法，與普通PCR捕獲SNP方法相比較，成本偏高，周期偏長。
[0005] 現(xiàn)有技術無法通過一步檢測同時完成單基因遺傳病、染色體異常和連鎖分析Ξ 項，而由少量細胞獲得的全基因組樣本，實驗過程中分別進行多種檢測容易出現(xiàn)等位基因 脫扣(ADO)、污染等現(xiàn)象，本領域急需一種能夠解決該問題的技術方案。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術中的不足，提供一種同時完成基因位點、染 色體及連鎖分析的方法，利用MALBAC擴增技術結合高通量測序，一步完成胚胎單基因遺傳 病、染色體疾病及連鎖分析等綜合性檢測，適用范圍廣，避免了使用多方法、多步驟分別進 行單基因遺傳病突變位點、染色體疾病和連鎖分析的檢測。本發(fā)明操作簡單、工作周期短， 實踐可行性強，尤其利用高通量測序方法，檢測和數(shù)據(jù)分析快速。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案具體如下所示：
[0008] -種同時完成基因位點、染色體及連鎖分析的方法，包括W下各步驟：
[0009] (1)胚胎細胞樣本的獲得:通過單精子注射獲得受精卵，培養(yǎng)至囊胚期在外滋養(yǎng)層 細胞分離獲得包含3-10個細胞的樣本，其中胚胎細胞可W選自人或者其他哺乳動物。
[0010] (2)全基因組擴增:在樣本中加入裂解液放入PCR儀中進行裂解、失活蛋白酶，對獲 得的細胞裂解樣本進行全基因組擴增，優(yōu)選采用多重退火環(huán)狀擴增技術(MALBAC)實現(xiàn);具 體而言，在細胞裂解樣本中加入預擴增混合液進行第一輪線性擴增，之后再加入擴增混合 液進行第二輪指數(shù)擴增，將擴增產(chǎn)物進行純化;MLBA訝廣增后的產(chǎn)物在300-2000bp之間。
[0011] 其中，第一輪線性擴增的條件為：
[0012] (1)90-98°C 反應 90s-5min;
[0013] (2)15-25°C 反應 30s-lmin;
[0014] (3)25-35°C 反應 30s-lmin;
[0015] (4)35-45°C 反應 20s-lmin;
[0016] (5)45-55°C 反應 20s-lmin;
[0017] (6)55-65°C 反應 20s-lmin;
[001 引（7)65-85°C 反應 2min-6min;
[0019] (8)90-98°C 反應 10-40S;
[0020] (9)45-65°C 反應 5-20s;
[0021] (10)重復步驟(2)到步驟(9)5至20個循環(huán)。
[0022] 第二輪指數(shù)擴增的條件為：
[0023] (1)90-98°C 反應 10S-50S;
[0024] (2)90-98°C 反應 10S-40S;
[00 巧](3)45-65°C 反應 20S-45S;
[00%] (4)65-80°C 反應 75s-5min;
[0027] (5)重復步驟(2)到步驟(4)10至30個循環(huán)；
[00%] (6)將擴增后的產(chǎn)物在0-5°C保存。
[0029] (3)目的基因突變位點擴增:在完成引物設計、引物評估之后，將目的基因突變位 點進行普通PCR擴增獲得PCR產(chǎn)物，將同一樣本的PCR產(chǎn)物與步驟(2)中獲得的片段化的基因 組DNA按照1:(1-100)的質量比混合。其中在進行引物設計時，引物長度為20-2加 P，擴增片 段大小根據(jù)測序用的reads來進行調整設計，單端的不能超過reads長度，雙端的不能超過2 倍長。
[0030] (4)MALBA訝廣增產(chǎn)物與目的基因突變位點進行建庫。
[0031] (5)采用高通量測序平臺，對樣本進行測序;如果只進行單基因致病位點和染色體 拷貝數(shù)變異(CNV)分析，每個標本測序平均深度最低為基因組的0.1倍;如果要同時獲得SNP 連鎖信息，每個標本需測序平均深度最低為基因組的2倍。
[0032] (6)數(shù)據(jù)分析
[0033] (6.1)將步驟(5)獲得的測序結果去掉接頭W及低質量數(shù)據(jù)，采用比對軟件比對到 參考基因組；
[0034] (6.2)下機的數(shù)據(jù)經(jīng)質控后比對到參考序列上，統(tǒng)計位點的等位基因的分布及其 頻率，檢測目的基因位點突變信息；
[0035] (6.3)下機的數(shù)據(jù)經(jīng)質控后比對到參考序列上，序列按照一定窗口進行GC矯正，W 幾千例MLBA訝廣增的單細胞數(shù)據(jù)為數(shù)據(jù)庫進行修正，最終檢測出染色體拷貝數(shù)變異(CNV);
[0036] (6.4)采用5^-單體型進行連鎖分析：
[0037] (6.4.1)選擇SNP區(qū)域，界定在目的基因上下游1M范圍內；
[0038] (6.4.2)用軟件獲得目標區(qū)域的SNP，所述軟件包括但不限于samtools mpileup， GATK，RreeBayes，化'5。日11 中的至少一種；
[0039] (6.4.3)SNP過濾:等位基因雜合度差異最低為10%，除去潛在錯誤的SNP;
[0040] (6.4.4)篩選區(qū)分型SNP，并構建父本和母本SNP-單體型：同一SNP位點，在父本和 母本的4個等位基因堿基中，有1個堿基不同于其他3個即可區(qū)分；
[0041 ] (6.4.5)分析SNP-單體型：胚胎SNP-單體型有2個，分別遺傳自父本和母本各1條， 根據(jù)區(qū)分型SNP和孟德爾遺傳原理，判斷其SNP-單體型具體哪個是父源遺傳，哪個是母源遺 傳;其中區(qū)分型SNP最低為10個，若有3個W上SNP錯誤，此胚胎SNP-單體型數(shù)據(jù)視為數(shù)據(jù)量 不足，難W進行分析；
[0042] (6.4.6)結果分析:根據(jù)步驟(6.4.4)確定父本和母本SNP-單體型，區(qū)分出與致病 位點連鎖的單體型，將胚胎所在SNP的具體等位基因對比，根據(jù)孟德爾遺傳原理，判斷胚胎 是否攜帶致病基因位點。
[0043] 優(yōu)選地，所述步驟(2)中第一輪線性擴增的條件為：
[0044] (1)94°C 反應 3min;
[0045] (2)20°C 反應 40s;
[0046] (3)30°C 反應 40s;
[0047] (4)40°C 反應 30s;
[004引（5)50°C 反應 30s;
[0049] (6)60°C 反應 30s;
[0050] (7)70。(3反應4111111;
[0化1] (8)95°C 反應 20s;
[0化2] (9)58°C 反應 10s;
[0053] (10)重復步驟(2)到步驟(9)8個循環(huán)。
[0054] 優(yōu)選地，所述步驟(2)中第二輪指數(shù)擴增的條件為：
[0化5] (1)94°C 反應 30s;
[0化6] (2)94°C 反應 20s;
[0化7] (3)58°C 反應 30s;
[0化引（4)72°C 反應 3min;
[0059] (5)重復步驟(2)到步驟(4)17個循環(huán)；
[0060] (6