將亞利桑那菌lamp法檢測用的引物和檢測方法
【專利說明】將亞利桑那菌LAMP法檢測用的弓I物和檢測方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及分子生物學中用LAMP法對亞利桑那菌DNA的檢測。
[0003]
技術(shù)背景
[0004]目前食品中對亞利桑那菌的檢測工作仍然沿用傳統(tǒng)的兩種細菌學鑒定方法。
[0005]第一種分離純化鑒定方法的缺點:按最新的亞利桑那菌檢測上述國家標準GB4789.4-2010中采用的傳統(tǒng)的分離純化鑒定方法，陽性樣品檢測周期至少需6天以上;且步驟繁瑣，需經(jīng)過5個步驟才能檢測出樣品是否含有目標菌;使用平板瓊脂分離純化細菌時，需要依靠經(jīng)驗選取可疑菌落，人為因素影響檢測結(jié)果，還極易造成漏檢。
[0006]第二種抗原抗體反應(yīng)方法的缺點:目前沙門氏菌分型仍然采用傳統(tǒng)的抗原和生化標準，將沙門氏菌分為四個亞屬，亞利桑那菌是沙門氏菌的第m亞屬，近3000種血清型，血清數(shù)量太大，如要在基層檢測實驗室配備大量價格昂貴的鑒定血清難以實現(xiàn)，因此在實際檢測工作中基本失去價值。傳統(tǒng)的亞利桑那菌檢測方法早已不能滿足現(xiàn)代食品安全檢測工作的需要，必須開發(fā)快速、簡便、高通量、高特異性、高靈敏度的檢測方法，來豐富和完善食品中致病菌的檢測。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種用擴增DNA的LAMP法，檢測亞利桑那菌的引物，并且還提供用這種引物對亞利桑那菌進行LAMP法檢測的方法，既提供一種比傳統(tǒng)細菌學鑒定亞利桑那菌更具有費用低、靈敏度高、操作簡便的LAMP法檢測亞利桑那菌的方法。
[0009]
本發(fā)明所說的亞利桑那菌是:亞利桑那菌Salmonella arizonae。
[0010]用本發(fā)明的引物的作用是，使用分子生物學LAMP檢測方法，在樣品中檢測出亞利桑那菌DNA。
[0011]用本發(fā)明設(shè)計的LAMP引物與引物是同一個概念。
[0012]本發(fā)明的LAMP技術(shù)也是LAMP法的含義，也就是環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(10p-mediatedisothermaI amplificat1n，)簡稱LAMP技術(shù)或LAMP法或LAMP檢測法。
[0013]本發(fā)明的引物設(shè)計和應(yīng)用概述:首先對以往文獻進行梳理，分析了沙門氏菌屬，包括亞利桑那菌spvA基因、16SrRNA、0RF的部分基因序列，最終確定spvA基因作為模版檢測基因。最終確定spvA基因作為_吳版檢測基因的參考文獻是:
第一參考文章名稱為:Toward a populat1n genetic analysis of Salmonella:Genetic diversity and relat1nships among strains of serotypes S.choleraesuis, S.derby , S.dublin , S.enteritidis, S.heidelberg, S.infantis, S.newport, and S.typhimuriu
第一參考文章作者為:PILAR BELTRAN*t, JAMES M.MUSSER*，REINER HELMUTHt,JOHN J.FARMER iii§, WAYNE M.FRERICHSH, 1.KAYE WACHSMUTH§, KATHLEEN FERRISH, ALMA C.MCWHORTER§, JOY G.WELLS§, ALEJANDRO CRAV1TOt, AND ROBERT K.SELANDER*
第一參考文章期刊名和時間為:Proc.Nat1.Acad.Sc1.USA Vol.85， pp.7753-7757， October 1988 Medical Sciences。
[0014]
第二參考文章名稱為:Salmonella Virulence Plasmid: Modular Acquisit1n ofthe spv Virulence Reg1n by an F-Plasmid in Salmonella enterica Subspecies Iand Insert1n Into the Chromosome of Subspecies II， Ilia, IV and VII Isolates第二參考文章作者為:E.Fidelma Boyd and Daniel L.Hartl
第二參考文章期刊名和時間為:Copyright O 1998 by the Genetics Society ofAmerica0
[0015]
在GENBANK數(shù)據(jù)庫中，對亞利桑那菌spvA這段基因序列進行檢索比對，發(fā)現(xiàn)亞利桑那菌與同屬中的其它沙門氏菌僅有39個堿基序列差異，為亞利桑那菌保守且特異的DNA序列，因此確定這39個堿基序列
CCGACCCTGCAGCTGGTTAATGACATTCTGGAGAATAAT
能夠作為LAMP法檢測亞利桑那菌的被檢特異DNA序列。然后用這個選定的被檢特異DNA序列為基礎(chǔ)，進行設(shè)計用于LAMP法檢測亞利桑那菌的檢測用的引物，然后并合成這種檢測用的引物，再把這種檢測用的引物用LAMP法檢測亞利桑那菌。
[0016]
本發(fā)明的引物設(shè)計原理如下:
(I)選取SpvA基因作為靶基因序列:因spvA基因在沙門氏菌屬中高度保守，可作為檢測沙門氏菌屬靶基因序列。
[0017](2)獲取靶基因序列:按當前生物基因組數(shù)據(jù)的獲取通用方法，即通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，Nat1nal Center for B1technology Informat1n，)管理的GENEBANK數(shù)據(jù)庫進行查詢，所獲序列都是對全世界公開的，研究人員都可以無償獲取使用的亞利桑那菌spvA基因作為靶基因序列。所以，本發(fā)明選用GENEBANK數(shù)據(jù)庫中的亞利桑那菌spvA基因DNA作為本發(fā)明的靶基因序列。
[0018]
(3)選靶基因中的特異性DNA片段:我們選取GENEBANK數(shù)據(jù)庫中的亞利桑那菌spvA基因DNA序列中保守性最高的、LAMP法檢測效果最好的一段DNA作為引物的基礎(chǔ)DNA來設(shè)計LAMP法檢測用的檢測用的引物，在GENBANK中對這段基因序列進行檢索比對，發(fā)現(xiàn)亞利桑那菌與同屬中的其它沙門氏菌僅有39個堿基片段差異，為亞利桑那菌保守且特異性DNA片段，既39個堿基片段如下:
CCGACCCTGCAGCTGGTTAATGACATTCTGGAGAATAATo
[0019](4)設(shè)計LAMP引物:用上述(3)中的39個堿基片段為依據(jù)，用現(xiàn)有引物設(shè)計技術(shù)，設(shè)計出本發(fā)明的LAMP法檢測用的引物，即本發(fā)明的4個單獨引物組成的引物組序列如下:
弓 I 物F3: AGCAGTTCCGCCGTCG引物B3: AGGGCTGGATATCGGGTC引物FIP: GGGTCGGTATTTGCTGGTTAAGGGACAGGCAGAGCG引物BIP: CTGGAGAATATTGCCACTGCGCCAGCGTTTCATCC。
[0020]
設(shè)計本發(fā)明的4個單獨引物既引物組的規(guī)則:
按LAMP反應(yīng)原理，每次LAMP反應(yīng)需4個單獨引物同時反應(yīng)，這4個單獨引物作為一個引物組，即每組LAMP弓丨物為4個單獨引物，本發(fā)明的引物組中4個單獨引物代號是:B3，F(xiàn)3，BIP，F(xiàn)IP0
[0021 ]設(shè)計引物時，B3，F(xiàn)3，BIP，F(xiàn)IP引物5 ’和3 ’最開始的一個堿基保證在5個物種中都是保守的；引物中5’dG和3’dG盡量小于-4.00。
[0022]
用本發(fā)明的LAMP引物，進行LAMP法檢測樣品中亞利桑那菌、其它干擾菌和滅菌去離子水對照的檢測方法如下:
步驟1、制備含亞利桑那菌標準菌種0嫩:225!111緩沖蛋白胨水(8?￥，81^€6^(1 PeptoneWater)中添加亞利桑那菌標準菌種CMCC47001，培養(yǎng)18_24小時后，用滅菌生理鹽水對緩沖蛋白胨水BPW培養(yǎng)液進行梯度稀釋，使用GB 4789.2-2010方法對進行細菌計數(shù)，分別制得含有亞利桑那菌濃度為18 CFU/mL,107 CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL四種梯度稀釋液，然后將這四種梯度稀釋液分別取lml，采用水煮模板法或CTAB/NaCl法或QIAGEN公司試劑盒方法中的某一種方法，分別提取這四種梯度稀釋液中的亞利桑那菌標準菌DNA;
得到，
第一種試驗菌液:含亞利桑那菌濃度為18 CFU/mL的