GGT GGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC。
[0030]在上述試劑盒的一個(gè)實(shí)施方式中，所述單鏈信號(hào)探針DNA(Sp)為CCCTTACCCCGGTGTCCCATGCTCCC。
[0031]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述DNA擴(kuò)增體系包括緩沖溶液(Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2S04)、dNTP 和 Phi29DNA 聚合酶。
[0032]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述外切酶為ExoIII核酸外切酶。
[0033]使抗赭曲霉毒素A核酸適體(Apt)與單鏈信號(hào)探針DNA(Sp)雜交(下劃線部分)；當(dāng)有赭曲霉毒素A存在時(shí)，雜交鏈與赭曲霉毒素A反應(yīng)釋放出Sp ；體系中有Apt-Sp(剩余的)，Apt-赭曲霉毒素A和Sp ；銀離子在Apt-赭曲霉毒素A體中不能還原生成熒光發(fā)射峰在650nm左右的銀納米簇，Apt-赭曲霉毒素A的存在對(duì)測(cè)定無(wú)干擾;雜交鏈可能有干擾;為了消除雜交鏈的干擾:a.利用DNA擴(kuò)增，使雜交鏈成雙鏈DNA，b.用外切酶，將雙鏈DNA切成碎片。此時(shí)體系中只留下信號(hào)探針DNA，再先后向該體系中加入銀離子溶液和硼氫化鈉溶液，此時(shí)，溶液中生成熒光發(fā)射峰在650nm左右的Sp修飾銀納米簇，通過(guò)檢測(cè)體系熒光強(qiáng)度，測(cè)定真菌毒素赭曲霉毒素A的含量。
[0034]具體操作過(guò)程如下:
[0035]將各DNA儲(chǔ)備液在90°C下經(jīng)加熱處理5分鐘，使用前，并在室溫下放置30分鐘。然后，分別取含2.5μηιο1抗赭曲霉毒素A核酸適體(Apt)的雜交緩沖溶液30yL和2.5μηιο1信號(hào)探針(Sp)的雜交緩沖溶液30yL置于2ml離心管中，在在37°C下雜交I小時(shí)，生成抗赭曲霉毒素A核酸適體-信號(hào)探針雜交物(Apt-Sp ssDNA)。
[0036]在37°C下，分別依次將濃度為O?50ng/mL的赭曲霉毒素A添加到Apt-SpssDNA溶液中，赭曲霉毒素A與抗赭曲霉毒素A核酸適體-信號(hào)探針雜交鏈反應(yīng)，生成抗赭曲霉毒素A核酸適體-赭曲霉毒素A，釋放出Sp ssDNA。這時(shí)，體系中有Sp ssDNA、剩余(未反應(yīng)的)Apt-Sp ssDNA和抗赭曲霉毒素A核酸適體-赭曲霉毒素A等物質(zhì)。
[0037]加入1yL擴(kuò)增緩沖溶液(緩沖溶液組成為50mM Tris-HCl11mM MgCl2,1mM(NH4)2S04，pH 7.5)，然后加入dNTP(10mM)10yL。再向體系中加入IyL Phi29DNA聚合酶(lOu/μΙ)，在37°C下反應(yīng)10?30分鐘，使得以抗赭曲霉毒素A核酸適體-信號(hào)探針雜交序列(Apt-SpssDNA)為摸板擴(kuò)增成雙鏈DNA。在65°C下保持10分鐘使Phi29DNA去活，然后冷卻至室溫。
[0038]再向該反應(yīng)體系中加入2yL Exo III核酸外切酶(20u/yL)，在37°C下反應(yīng)30分鐘，使選擇性地將雙鏈DNA切割成碎片，單鏈探針Sp不被切割而保留下來(lái)。溶液加熱至95°C保持
5分鐘使核酸外切酶Exo III失活，并將溶液放置于冰浴中迅速冷卻至室溫。
[0039]向反應(yīng)液中加入15yLImmoI硝酸銀和120yL檸檬酸鈉緩沖液(1mM，pH7.0)。然后，混合物在室溫下暗室或避光中放置10分鐘后，在快速攪拌下，加入10yL濃度為200μΜ的新制備的硼氫化鈉溶液。然后在45°C下反應(yīng)5min。將溶液轉(zhuǎn)移至微量比色皿，以波長(zhǎng)為590nm光為激發(fā)光，測(cè)定體系610-800nm的熒光強(qiáng)度，進(jìn)行赭曲霉毒素A的定量測(cè)定。測(cè)定結(jié)果如圖1所示。
[0040] 線性范圍0.008-(h40ng/mL，檢測(cè)限0.8pg/mL，回收率在95.5?106%。赭曲霉毒素
B、黃曲霉素B1、伏馬毒素、維生素C、葡萄糖等生物小分子不干擾赭曲霉毒素A的檢測(cè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測(cè)赭曲霉毒素A的方法，所述方法包括: (A)使抗赭曲霉毒素A核酸適體(Apt)和可與抗赭曲霉毒素A核酸適體雜交的單鏈信號(hào)探針DNA( Sp)雜交，形成雜交鏈； (B)使該雜交鏈與待測(cè)樣品作用，當(dāng)待測(cè)樣品中有赭曲霉毒素A存在時(shí)，雜交鏈選擇性地與赭曲霉毒素A反應(yīng)釋放出單鏈信號(hào)探針DNA ； (C)為了消除雜交鏈的干擾，利用DNA擴(kuò)增使雜交鏈成雙鏈DNA，用外切酶，將雙鏈DNA切成碎片； (D)利用銀離子在抗赭曲霉毒素A核酸適體-赭曲霉毒素A的結(jié)合體中不能還原生成熒光發(fā)射峰在650nm左右的銀納米簇，銀離子只能在單鏈信號(hào)探針DNA中還原并生成被Sp修飾的熒光發(fā)射峰在650nm左右的銀納米簇的原理，在銀離子還原檢測(cè)體系中檢測(cè)體系熒光強(qiáng)度，測(cè)定真菌毒素赭曲霉毒素A的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述抗赭曲霉毒素A核酸適體為GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述單鏈信號(hào)探針DNA(Sp)為CCCTTACCCCGGTGTCCCATGCTCCC。4.一種用于檢測(cè)赭曲霉毒素A的試劑盒，其至少包括:抗赭曲霉毒素A核酸適體，可與抗赭曲霉毒素A核酸適體雜交的單鏈信號(hào)探針DNA，DNA擴(kuò)增體系、外切酶、銀離子還原檢測(cè)體系O5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其中，所述抗赭曲霉毒素A核酸適體為GATCGGGTGTGGGT GGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其中，所述單鏈信號(hào)探針DNA(Sp)為CCCTTACCCCGGTGTCCCATGCTCCC。7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，所述DNA擴(kuò)增體系包括緩沖溶液(Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2S04)、dNTP和Phi29DNA聚合酶。8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，所述外切酶為ExoIII核酸外切酶。9.一種用于檢測(cè)赭曲霉毒素A的抗赭曲霉毒素A核酸適體:其堿基序列為GATCGGGTGTGGGT GGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)赭曲霉毒素的方法及試劑盒，所述方法包括：(A)使抗赭曲霉毒素A核酸適體(Apt)和可與抗赭曲霉毒素A核酸適體雜交的單鏈信號(hào)探針DNA(Sp)雜交，形成雜交鏈；(B)使該雜交鏈與待測(cè)樣品接觸，當(dāng)待測(cè)樣品中有赭曲霉毒素A存在時(shí)，雜交鏈與赭曲霉毒素A反應(yīng)釋放出單鏈信號(hào)探針DNA；C)利用DNA擴(kuò)增使雜交鏈成雙鏈DNA，用外切酶，將雙鏈DNA切成碎片，留下單鏈信號(hào)探針DNA；(D)在銀離子還原檢測(cè)體系中檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度，測(cè)定真菌毒素赭曲霉毒素A的含量。根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法和試劑盒，可以消除干擾，提了高抗赭曲霉毒素A的檢測(cè)靈敏度和精度。
【IPC分類】C12N15/115, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105543344
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510945609
【發(fā)明人】易守軍, 冉海寧, 林雨歡, 曾云龍, 鄧克勤, 唐春然
【申請(qǐng)人】湖南科技大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2015年12月17日