赭曲霉毒素a的快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米生物傳感以及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是提供一種赭曲霉毒素A的快速檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]赭曲霉毒素包括7種結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物，結(jié)構(gòu)通式:Rl=Cl或H； R2=H、CH3或C2H5。其中赭曲霉毒素A(R1=C1，R2=H)毒性最大，在霉變谷物、飼料等最常見(jiàn)。
[0003]赭曲霉毒素A是曲霉和青霉等真菌產(chǎn)生的，廣泛污染小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類(lèi)等糧食，也污染花生、蔬菜(豆類(lèi))。動(dòng)物攝入了霉變的飼料后，這種毒素就可能出現(xiàn)在其肉中。人類(lèi)就會(huì)直接或間接地攫入赭曲霉毒素。赭曲霉毒素主要損害肝臟與腎臟，也能引起腸黏膜炎癥和壞死，并有致畸作用。因此對(duì)赭曲霉毒素A的檢測(cè)是十分必要的。
[0004]目前，對(duì)赭曲霉毒素A檢測(cè)方法主要是色譜技術(shù)，包括薄層色譜(TLC)，氣相色譜(GC)，高效液相色譜(HPLC)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等。近年來(lái)，發(fā)展了基于核酸適體的真菌毒素新的檢測(cè)方法。如B1sensors and B1electronics 57(2014)226-231 公開(kāi)了一種用于赭曲霉毒素A的檢測(cè)的基于DNA骨架的銀納米簇的熒光適體傳感器(AFluorescent Aptasensor based on DNA—scaffolded Silver-nanocluster forOchratoxin A Detect1n)。
[0005]中國(guó)專(zhuān)利CN102830113B公開(kāi)了一種目標(biāo)誘導(dǎo)鏈釋放和限制性?xún)?nèi)切酶酶切循環(huán)的信號(hào)放大技術(shù)在赭曲霉素A超靈敏度檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0006]中國(guó)專(zhuān)利CN102517288A公開(kāi)了一種赭曲霉毒素A核酸適體及其應(yīng)用，該核酸適體可以用于赭曲霉毒素A的檢測(cè)分析和分離富集。
[0007]通常，色譜法用于食品中痕量真菌檢測(cè)存在靈敏度不夠的問(wèn)題，液-質(zhì)聯(lián)用法雖然靈敏度高、快速，但設(shè)備昂貴、應(yīng)具有專(zhuān)門(mén)操作技術(shù)人員才能進(jìn)行檢測(cè)，技術(shù)要求高，不宜大眾化和普及，而文獻(xiàn)所述的基于核酸適體檢測(cè)赭曲霉真菌毒素方法或存需要用到價(jià)格昂貴的經(jīng)標(biāo)記(生物材料等)的DNA，或操作復(fù)雜等不足之處。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供一種檢赭曲霉毒素A的方法。
[0009]本發(fā)明采用的技術(shù)方案:一種檢赭曲霉毒素A的方法，該方法包括如下步驟:
(A)赭曲霉毒素A核酸適體(Apt)與單鏈信號(hào)探針DNA(ssDNA)雜交，形成雜交鏈；
(B)將待測(cè)樣品溶液加入到該雜交鏈溶液，當(dāng)待測(cè)樣品中有赭曲霉毒素A時(shí)，雜交鏈選擇性地與赭曲霉毒素A反應(yīng)釋放出單鏈信號(hào)探針ssDNA;
(C)消除雜交鏈的干擾，利用DNA擴(kuò)增，使雜交鏈成雙鏈DNA，然后用核酸外切酶選擇性地催化雙鏈DNA水解成單核苷酸，而單鏈信號(hào)探針ssDNA不水解而保留下來(lái)；
(D)利用赭曲霉毒素A核酸適體-赭曲霉毒素A結(jié)合體不能誘導(dǎo)銅離子還原成近紅外熒光的銅納米粒子，只有單鏈信號(hào)探針ssDNA能誘導(dǎo)銅離子還原成近紅外熒光銅納米粒子，在銅離子還原檢測(cè)體系中檢測(cè)體系熒光強(qiáng)度，從而測(cè)定待測(cè)樣品中的赭曲霉毒素A的含量。
[0010]所述銅離子還原檢測(cè)體系包括先后添加的銅離子和使銅離子還原成近紅外熒光銅納米粒子的抗壞血酸還原劑。步驟(D)的檢測(cè)，例如包括依次先后向體系中加入銅離子溶液和抗壞血酸溶液，反應(yīng)后生成近紅外熒光銅納米粒子。
[0011 ]所述赭曲霉毒素A核酸適體為
5，-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC-3，。
[0012]所述可與赭曲霉毒素A核酸適體雜交的單鏈信號(hào)探針ss D N A為5 ’ -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTCCCATGCTCC_3’。
[0013]本發(fā)明的檢測(cè)原理如下:先讓Apt與ssDNA雜交；當(dāng)有赭曲霉毒素A存在時(shí)，雜交鏈與赭曲霉毒素A反應(yīng)釋放出ssDNA;體系中存在Apt- ssDNA (剩余的)，Apt_赭曲霉毒素A和ssDNA ^pt-赭曲霉毒素A不能誘導(dǎo)銅離子還原成近紅外熒光銅納米粒子，Apt-赭曲霉毒素A存在對(duì)測(cè)定無(wú)干擾;雜交鏈可能有干擾;為了消除雜交鏈的干擾:a.利用DNA擴(kuò)增，使雜交鏈成雙鏈DNA，b.用核酸外切酶選擇性地催化雙鏈DNA水解成單核苷酸，而單鏈信號(hào)探針ssDNA不水解而保留下來(lái)。此時(shí)體系中只留下可誘導(dǎo)生成近紅外熒光銅納米粒子的ssDNA，通過(guò)檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度，以波長(zhǎng)為340 nm光為激發(fā)光，測(cè)定體系熒光發(fā)射(520-660 nm)光譜的熒光強(qiáng)度，依據(jù)熒光強(qiáng)度與赭曲霉素的量的關(guān)系，可以測(cè)定赭曲霉毒素A的含量。由于消除體系中背景熒光的干擾，提高了檢測(cè)的靈敏度和精度。
[0014]本發(fā)明另外提供了一種檢測(cè)赭曲霉毒素A的試劑盒，其至少包括:赭曲霉毒素A核酸適體、可與赭曲霉毒素A核酸適體雜交的單鏈信號(hào)探針ssDNA、DNA擴(kuò)增體系、外切酶、銅離子還原檢測(cè)體系。
[0015]所述的赭曲霉毒素A 核酸適體為 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC-3，。
[0016]所述的單鏈信號(hào)探針 s s D N A 為 5 ’ -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTCCCATGCTCC_3’。
[0017]所述DNA擴(kuò)增體系包括緩沖溶液，緩沖溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4組成、三磷酸脫氧單核苷酸混合溶液(dNTP)和Phi29 DNA聚合酶。
[0018]所述外切酶為Exo III核酸外切酶。
[0019]所述的銅離子還原檢測(cè)體系中還原劑為抗壞血酸。
[0020]本發(fā)明還提供了一種可用于檢測(cè)赭曲霉毒素A的赭曲霉毒素A核酸適體，其堿基序列為5 ’ -GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC-3 ’。
[0021 ]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法和試劑盒，消除了背景熒光的干擾，提高了赭曲霉毒素A的檢測(cè)靈敏度和精度。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為ssDNA-Ag納米粒子熒光強(qiáng)度與赭曲霉毒素A的濃度關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1 本發(fā)明的檢測(cè)赭曲霉毒素A的試劑盒至少包括:赭曲霉毒素A核酸適體、單鏈信號(hào)探針ssDNA、DNA擴(kuò)增體系、核酸外切酶、銅離子還原檢測(cè)體系。所述赭曲霉毒素A核酸適體為5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC-3’。所述的單鏈信