一組用于腸癌早期診斷的ndrg4基因甲基化檢測引物和探針及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領域。更具體地，設及一組用于腸癌早期診斷的NDRG4基 因甲基化檢測引物和探針及其檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸癌（colorectal cancer，CRC)是臨床最常見的惡性腫瘤之一，近些年隨著經(jīng) 濟的發(fā)展，人們的生活方式尤其是飲食結(jié)構(gòu)的變化，腸癌已經(jīng)成為我國發(fā)病率上升最快的 惡性腫瘤之一，嚴重威脅著國人的生命和健康。而且，晚期患者預后很差，目前，對腸癌進行 早期診斷早期治療W提高腸癌的治愈率，降低死亡率，已經(jīng)成為迫切的需要。
[0003] DNA甲基化常常是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的早期事件，因此，特異基因的甲基化可作 為腫瘤早期診斷的分子標志物。NDRG4(N-myc downs化eam-reguiated gene 4)為抑癌基因 NDRG基因家族成員之一，NDRG4基因長32化，由17個外顯子及16個內(nèi)含子組成，大量研究表 明該基因與腫瘤細胞的生長、分化和轉(zhuǎn)移有一定關系，其基因5'端調(diào)控區(qū)域含有CpG島，在 結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中常常被甲基化，NDRG4基因甲基化被認為是結(jié)直腸癌的重要生物 學特征(Veerie等）。因此，NDRG4基因是候選腫瘤抑制基因和直腸癌的潛在生物標志物， NDRG4啟動子的甲基化可作為生物標志物，用于早期診斷結(jié)直腸癌。
[0004] 而對于NDRG4基因甲基化的檢測而言，檢測敏感性和特異性是尤其至關重要的因 素，對腸癌早期診斷的準確判斷具有重要的意義。而檢測敏感性和特異性受多方面因素的 影響，因此，對于保證和提高NDRG4基因甲基化檢測敏感性和特異性的相關研究，是利用該 基因進行腸癌早期診斷的重點和難點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有利用NDRG4基因檢測進行腸癌早期診斷技術(shù) 的不足和缺陷，提供一種高敏感性、高特異性的NDRG4基因甲基化檢測引物和探針，而且檢 測樣本可使用方便獲取處理的糞便樣品，非常適用于臨床篩查，對腸癌的早期診斷具有重 要的意義。
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一組用于腸癌早期診斷的NDRG4基因甲基化檢測引物和探針
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種利用上述引物和探針制備出的NDRG4基因甲基化檢 測試劑盒。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0009] -組用于腸癌早期診斷的NDRG4基因甲基化檢測引物和探針，所述引物為NDRG4- 1FP和NDRG4-1RP，其核巧酸序列分別如SEQ ID NO. 1和2所示;所述探針為NDRG4-2Pb，其核 巧酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010] 一種用于腸癌早期診斷的NDRG4基因甲基化檢測試劑盒，包含有上述引物NDRG4- 1FP、NDRG4-1RP 和探針 NDRG4-2Pb。
[0011] 進一步地，上述試劑盒還包括利用引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探針NDRG4-2饑進 行PCR擴增時，獲得PC財莫板所需試劑，所需試劑包括提取待測樣品DNA時捕獲目的片段的捕 獲探針NDRG4-CP，捕獲探針NDRG4-CP的核巧酸序列如SEQIDN0.4所示。
[0012] 優(yōu)選地，上述引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探針NDRG4-2Pb的使用濃度均為50~ 500μΜ。
[0013] 更優(yōu)選地，上述引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探針NDRG4-2饑的使用濃度均為100μ Μ。
[0014] 進一步優(yōu)選地，上述檢測試劑盒還包括利用引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探針 NDRG4-2Pb進行PCR擴增時，PCR擴增體系試劑，包括dNTP、儀離子、反應緩沖液(buf f er)、酶、 無核酸酶的水。
[001引優(yōu)選地，所述體系試劑包括5~20mM的dNTP、10~40mM的儀離子、1 X~10 X反應緩 沖液、酶、無核酸酶的水。
[0016] 更優(yōu)選地，所述體系試劑包括5~15mM的dNTP、15~35mM的儀離子、1 X~10 X反應 緩沖液、酶、無核酸酶的水。
[0017] 最優(yōu)選地，所述體系試劑包括lOmM的dNTP、25mM的儀離子、5 X反應緩沖液（5 X buf f er)、酶、無核酸酶的水。
[0018] 優(yōu)選地，利用上述試劑盒進行NDRG4基因甲基化檢測時，PCR體系中各組分的反應 終濃度如下： 正向引物 0.1~2μΜ
[0019] 反向引物 0，1~2μΜ 賴針 0.1~ΙμΜ dNTP 0.1 ~2miVI 儀離子 2~lOmM:
[0020] 反應緩沖液 lx反應體系總體積 酶 Ο,?υ~0.61巧疋 無核酸酶的水 1X反應體系總體積。
[0021]更優(yōu)選地，利用上述試劑盒進行NDRG4基因甲基化檢測時，PCR體系按照如下比例 進行： 100μΜ的正向引物 0.125yL 100μΜ的反向引物 0.125yL 100μΜ ?向探針 0.05p.L lOmM 的 dNTP l^iL
[0022] 25mM 的儀離子 5μ1^ 5x反應議沖液（5沖u游r) 5陣 廳 〇.5.止 無核酸酶的水 8.2yL 待娜：DNA 5μΙ。
[0023] 更優(yōu)選地，所述酶為熱啟動聚合酶。如Promega公司的'Gotaq?).熱啟動酶或者SIGMA 公司的.1 unipUiq果熱啟動酶。
[0024] 另外，優(yōu)選地，利用上述試劑盒進行NDRG4基因甲基化檢測時，PCR程序如下：
[00 巧]95°C300s;l 個循環(huán)；
[0026] 95°C20s，62°C30s，70°C30s; 10 個循環(huán)；
[0027] 95°C20s，58°C60s，72°C30s; 30 ~40 個循環(huán)；
[002引 37°C30s;l 個循環(huán)。
[0029] 更優(yōu)選地，利用上述試劑盒進行NDRG4基因甲基化檢測時，PCR程序如下：
[0030] 95°C300s;l 個循環(huán)；
[0031 ] 95°C20s，62°C30s，70°C30s; 10 個循環(huán)；
[0032] 95°C20s，58°C60s，72°C30s; 35 ~40 個循環(huán)；
[0033] 37°C30s;l 個循環(huán)。
[0034] 另外，優(yōu)選地，上述待測樣品為糞便，上述試劑盒還包括糞便預處理試劑，預處理 試劑為研磨緩沖液。
[0035] 進一步優(yōu)選地，所述研磨緩沖液具體為:無核酸酶的水、生理鹽水、TE、或PBS中的 一種或多種。
[0036] 本發(fā)明上述引物和探針及其試劑盒在腸癌的早期診斷方面具有很好的應用前景。
[0037] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0038] 本發(fā)明針對腸癌的早期診斷，設計獲得了一組對NDRG4基因甲基化檢測效果非常 好的引物和探針，并且利用上述引物和探針，成功構(gòu)建了一套NDRG4基因甲基化檢測體系和 程序，并組建成試劑盒，對于NDRG4基因甲基化的檢測，具有高敏感性和特異性，能夠準確特 異診斷早期腸癌，對腸癌的早期診斷和篩查具有重要的意義和應用前景。
[0039] 另外，本發(fā)明上述的引物、探針及檢測試劑盒，可W使用糞便作為樣本，樣本處理 簡單、易取，并且檢測方法為普通PCR法，操作簡便、快速，只需75~90min左右的時間即可完 成檢測，無需高昂的儀器和檢測費用，非常適用于大量樣品的檢測W及基層篩查。
【附圖說明】
[0040] 圖1為引物組NDRG4-0FP/NDRG4-0RP的擴增結(jié)果。
[0041 ] 圖2為引物組NDRG4-1FP/NDRG4-1RP的擴增結(jié)果。
[0042] 圖3為引物組NDRG4-2FP/NDRG4-2RP的擴增結(jié)果。
[0043] 圖4為引物組NDRG4-3FP/NDRG4-3RP的擴增結(jié)果。
[0044] 圖5為引物組NDRG4-4FP/NDRG4-4RP的擴增結(jié)果。
[004引圖6為探針NDRG4-lPb的擴增結(jié)果。
[0046] 圖7為探針NDRG4-2Pb的擴增結(jié)果。
[0047] 圖8為探針NDRG4-3Pb的擴增結(jié)果。
[0048] 圖9為糞便樣品的檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0049] W下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本技術(shù)領域常規(guī)試 劑、方法和設備。
[0050] 除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。
[0051] 實施例1引物探針設計
[0052] 1、針對NDRG4基因甲基化的檢測，設計了大量引物，經(jīng)過篩選后獲得如下表1所示5 組引物。
[0053] 表1引物序列
[0054]
[00巧]2、探針設計
[0056] 針對NDRG4基因甲基化的檢測，設計了大量探針，經(jīng)過篩選后獲得如下表2所示3條 探針。
[0057] 表 2 [005引
[0059] 實施例2樣品檢測方法
[0060] 1、樣本處理和DNA提?。?br>[0061] (1)糞便樣本和緩沖液按照Ig糞便:4ml緩沖液的比例混合研磨后，離屯、留取上清 液，丟棄沉淀物。