一種大鱗副泥鰍與泥鰍雜交種的鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的雜交種鑒別方法，具體地說(shuō)涉及一種利用分子標(biāo)記鑒別大鱗副泥鰍與泥鰍雜交種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大鱗副泥嫩(Paramisgurnusdabryanus)隸屬于趣形目(Cypriniformes)，解火科(Cobitidae)，副泥嫩屬(Paramisgurnus)。泥嫩(Misgurnus anguillicaudatus)隸屬于趣形目(Cypriniformes)，鰍科(Cobitidae)，泥鰍屬(Misgurnus)。泥鰍在全國(guó)除青藏高原以外的淡水水域中均有分布，是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)魚類。泥鰍被喻為“水中人參”，具有多種藥用價(jià)值，又是傳統(tǒng)的大眾消費(fèi)對(duì)象，但是，由于泥鰍與大鱗副泥鰍形態(tài)相似，非專業(yè)人員一般不能準(zhǔn)確區(qū)分。近年國(guó)內(nèi)已經(jīng)興起了泥鰍的養(yǎng)殖熱潮，除養(yǎng)殖中國(guó)臺(tái)灣泥鰍外，主要養(yǎng)殖的是大鱗副泥鰍和泥鰍。大鱗副泥鰍和泥鰍是近緣，常常棲息在相同水域，且繁殖季節(jié)重疊。印杰等已證實(shí)了兩種泥鰍的稀有自然雜交行為。天然存在雜交現(xiàn)象，勢(shì)必會(huì)給兩種魚的生物學(xué)研究帶來(lái)諸多問(wèn)題，甚至關(guān)系到品種區(qū)分和出口檢驗(yàn)問(wèn)題。因此，亟需建立一套準(zhǔn)確的區(qū)分雜交種的方法。
[0003]雖然中國(guó)專利號(hào)為“201410775974.7”的現(xiàn)有技術(shù)在2015年4月8日公開了一種泥鰍和大鱗副泥鰍種質(zhì)鑒別引物和鑒別方法，但這種方法僅能用于鑒別純種的泥鰍和純種的大鱗副泥鰍，而不能用于鑒別大鱗副泥鰍與泥鰍的雜交種。因此，其方法的性能是有限的，尚不能解決雜交種的鑒定問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，提供一種大鱗副泥鰍和泥鰍雜交種的鑒別方法，本發(fā)明不僅能夠快速有效地對(duì)泥鰍和大鱗副泥鰍的雜交種進(jìn)行鑒別，還能夠鑒別雜交種的父本和母本是泥鰍還是大鱗副泥鰍。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0006]—種大鱗副泥鰍與泥鰍雜交種的鑒別方法，其特征在于包括以下步驟:
[0007](I)通過(guò)大鱗副泥鰍和泥鰍的兩種微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行相互種間擴(kuò)增，找到大鱗副泥解火和泥嫩的特異性標(biāo)記，大鱗副泥嫩的標(biāo)記是Pda71，泥嫩的標(biāo)記是Mac287和Mac375;
[0008](2)提取待鑒別泥鰍的DNA，并以該DNA為模板，以步驟(I)中的3個(gè)標(biāo)記分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得3種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0009](3)分別對(duì)步驟(2)中的3種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品只有Pda71標(biāo)記的一條帶時(shí)，該被測(cè)樣品為大鱗副泥鰍；當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品只有Mac287、Mac375標(biāo)記的兩條帶時(shí)，該被測(cè)樣品為泥鰍；當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品有Pda71、Mac287和Mac375標(biāo)記的三條帶時(shí)，該被測(cè)樣品為雜交種泥鰍；
[0010](4)提取經(jīng)步驟(3)中確認(rèn)為雜交種泥鰍的DNA，并以該DNA為模板，以線粒體標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再對(duì)該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品有285bp的一條帶時(shí)，確定該被測(cè)樣品為泥鰍早X大鱗副泥解M雜交子代；當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品有214bp的一條帶時(shí)，確定該被測(cè)樣品為大鱗副泥鰍早X泥鰍報(bào)]雜交子代。
[0011 ]所述步驟(I)中的相互種間擴(kuò)增包括泥鰍樣本用大鱗副泥鰍標(biāo)記的種間擴(kuò)增和大鱗副泥鰍樣本用泥鰍標(biāo)記的種間擴(kuò)增，其中，
[0012]泥鰍樣本用大鱗副泥鰍標(biāo)記的種間擴(kuò)增方法為:提取多尾泥鰍的DNA，并選取大鱗副泥鰍微衛(wèi)星標(biāo)記44個(gè)，以每尾泥鰍的DNA進(jìn)行種間PCR擴(kuò)增，得到以泥鰍純種完全不呈現(xiàn)的特異性標(biāo)記，該特異性標(biāo)記即為大鱗副泥鰍的特異性標(biāo)記Pda71;
[0013]大鱗副泥鰍樣本用泥鰍標(biāo)記的種間擴(kuò)增方法為:提取多尾大鱗副泥鰍的DNA，并選取泥鰍微衛(wèi)星標(biāo)記14個(gè)，以每尾大鱗副泥鰍的DNA進(jìn)行種間PCR擴(kuò)增，得到純種大鱗副泥鰍完全不呈現(xiàn)的特異性標(biāo)記，該特異性標(biāo)記即為泥鰍的特異性標(biāo)記Mac287和Mac375。
[0014]所述步驟(I)中相互種間擴(kuò)增時(shí)的泥鰍數(shù)量和大鱗副泥鰍數(shù)量均大于3尾。
[0015]所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系的總體積為20yL，反應(yīng)體系中包含的成分及含量為:2XPCR Taq PCR MasterMix 10yL，ΙΟμΜ的微衛(wèi)星標(biāo)記引物各lyL，20ng/yL的待鑒別泥鰍DNA模板IyL，雙蒸水體積為7yL。
[0016]所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min，然后30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性30s，退火30s，72°C延伸30s，最后在72°C下延伸lOmin。
[0017]所述電泳分析采用2%瓊脂糖凝膠電泳分析。
[0018]采用本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0019]一、本發(fā)明利用微衛(wèi)星標(biāo)記種間擴(kuò)增法，找到了 I個(gè)大鱗副泥鰍特異性標(biāo)記和2個(gè)泥鰍特異性標(biāo)記，通過(guò)這3個(gè)特異性標(biāo)記能夠快速有效地對(duì)泥鰍、大鱗副泥鰍以及兩者的雜交種進(jìn)行鑒別。并且，通過(guò)這3個(gè)特異性標(biāo)記結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)中的線粒體特異性標(biāo)記，還能夠準(zhǔn)確辨別出雜交種泥鰍的父本和母本是泥鰍還是大鱗副泥鰍。
[0020]二、本發(fā)明成功利用微衛(wèi)星標(biāo)記種間擴(kuò)增技術(shù)區(qū)分泥鰍和大鱗副泥鰍的雜交種，再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)中的線粒體標(biāo)記，創(chuàng)建了完整的大鱗副泥鰍和泥鰍雜種的鑒別方法。這些方法的發(fā)明為人們判斷二者的雜交現(xiàn)象提供了遺傳學(xué)方面的有力證據(jù)，也將為我們探究自然界泥鰍與大鱗副泥鰍的雜交遺傳規(guī)律和兩種間的遺傳特征研究提供有效方法。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為本發(fā)明中44個(gè)大鱗副泥鰍微衛(wèi)星標(biāo)記在兩種泥鰍中擴(kuò)增的部分電泳結(jié)果，其中，M.DNA ladder, 1-7:大鱗副泥嫩P.dabryanus，8-14:泥嫩M.anguillicaudatus。圖2為本發(fā)明中14個(gè)泥鰍微衛(wèi)星標(biāo)記在兩種泥鰍中擴(kuò)增的部分結(jié)果，其中，M:DNA ladders: 1-14為大鱗副泥鰍P.dabryanus，B: I_14為泥鰍M.
[0022]anguillicaudatus。
[0023]圖3為本發(fā)明中Pda71(A)、Mac287(B)、Mac375(C)在親本及雜交子代中的擴(kuò)增結(jié)果，其中，M.DNA ladder，1-5反交組(Pft^XMA早)，6-10正交組(MA^XPD早)。
[0024]圖4為本發(fā)明中特異性引物(Μ/P)在親本及雜交子代中的擴(kuò)增結(jié)果，其中，
[0025]M.DNA ladder，1-5反交組(Pft^XMA早)，6_10正交組(MA^XPD早)。
【具體實(shí)施方式】
[0026]—種大鱗副泥鰍與泥鰍雜交種的鑒別方法，包括以下步驟:
[0027](I)通過(guò)大鱗副泥鰍和泥鰍的兩種微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行相互種間擴(kuò)增，找到大鱗副泥鰍和泥鰍的特異性標(biāo)記。其中，通過(guò)大鱗副泥鰍和泥鰍的