水牛泌乳相關(guān)基因Leptin作為分子標(biāo)記的方法及其應(yīng)用
【專利說明】水牛泌乳相關(guān)基因 Lept i η作為分子標(biāo)巧的方法及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種水牛產(chǎn)奶性狀基因 Leptin 作為分子標(biāo)記的方法及其應(yīng)用。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 水牛是我國南方特有的種畜資源，而較低的產(chǎn)奶量和繁殖性能已成為了影響其產(chǎn) 業(yè)發(fā)展的兩大科學(xué)問題。顯然，利用先進(jìn)的分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于優(yōu)良奶水牛種質(zhì)資源的選 育將會有效的提高選種效率。
[0003] 產(chǎn)奶性狀是奶水牛的一個重要經(jīng)濟(jì)性狀，由多種微效基因決定，是一種典型的由 多基因控制的數(shù)量性狀?？寺∧趟Ｃ谌樾阅芟嚓P(guān)基因并探討其遺傳特性，W提高奶水牛 生產(chǎn)性能，為選育具有高產(chǎn)奶量的優(yōu)良的奶水牛品種提供技術(shù)支撐和奠定理論基礎(chǔ)。
[0004] Leptin基因又稱肥胖基因，編碼蛋白質(zhì)為瘦素，由脂肪細(xì)胞分泌，可控制哺乳動物 的采食量和體組成，對動物的生長、繁殖和泌乳性能具有重要作用。近些年，Leptin基因一 直受到畜牧研究者的重視，尤其在探究Leptin基因與家畜重要經(jīng)濟(jì)性狀間的相關(guān)性做出了 大量的分析。Konfodov等（1999)率先從22頭牛L邱tin基因中篩查出20個單核巧酸多態(tài)性 位點(diǎn)（Single Nuclease Polymo巧hism，SNP)，其中每89bp就存在一個SNP位點(diǎn)，且有6個SNP 位于外顯子上。隨后，Yoon等(2005)對24頭韓國牛Leptin基因的多態(tài)性進(jìn)行篩查，共發(fā)現(xiàn)57 個SNPs，其中有14個位于5'側(cè)翼區(qū)，27個在內(nèi)含子上，8個在外顯子區(qū)域，其余8個位于3'側(cè) 翼區(qū)。研究表明Leptin基因的多態(tài)性分布于不同的家畜中且與不同的生產(chǎn)性狀具有關(guān)聯(lián) 性，如Leptin基因口 3T位點(diǎn)突變與成牛禍體脂肪沉積增多有關(guān)，Leptin基因的SNP位點(diǎn)A80V 對牛的不返情率影響顯著，Leptin-1238中G相對于C來說顯著降低了牛的乳脂率和乳蛋白 率等。顯然，根據(jù)LEP基因功能，該基因可作為影響水牛產(chǎn)奶性狀的候選基因，用于分子標(biāo)記 的開發(fā)和利用，為建立分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)奠定基礎(chǔ)。而且，迄今為止，尚無有關(guān)水牛 Leptin基因作為水牛產(chǎn)奶性狀的分子標(biāo)記研究報(bào)道。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005] 本發(fā)明提供了一種水牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)基因 Leptin作為分子標(biāo)記的方法，該分子標(biāo) 記的方法是通過PCR-DNA測序與高分辨率溶解曲線化RM)技術(shù)完成的。
[0006] 水牛產(chǎn)奶性狀基因 Leptin的基因片段的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其中第 3683處有一個G/T單堿基突變，該位點(diǎn)與水牛品種的產(chǎn)奶量顯著相關(guān)(P<0.05)。
[0007] 進(jìn)一步提供一種檢測序列SEQ N0:1第3683bp處G/T堿基突變的正反向引物對的 DNA序列如下所示：
[000引 正向引物：5-GTGGTCTTGCTCATCAGGAAG-3，SEQ NO:2
[0009] 反向引物：5-TGTCTGCTGTTATGGTCTTAGG-3，SEQ NO:3
[0010] 本發(fā)明水牛產(chǎn)奶性狀L邱tin基因 G3683T處SNP位點(diǎn)的獲取方法，包括如下步驟：
[0011] (1)待測水?；蚪MDNA提??；
[0012] (2)目的片段擴(kuò)增及測序：隨機(jī)50頭水?；蚪MDM進(jìn)行混池，w作為PCR反應(yīng)模 板，利用SEQ N0:2-3引物進(jìn)行PCR技術(shù)擴(kuò)增，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物委托深圳華大科技有限公司進(jìn) 行測序，利用DNAStar T.OSeqman生物信息分析軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對，獲取候選的 Leptin基因 SNP位點(diǎn)；
[0013] (3)基因分型：針對360頭水牛基因組DNA樣本，利用高分辨率溶解曲線化RM)技術(shù) 進(jìn)行候選SNP位點(diǎn)的分型，得出各樣本位點(diǎn)的基因型；
[0014] (4)關(guān)聯(lián)分析:利用SAS軟件GLM程序?qū)λ€體的SNP分型結(jié)果W及產(chǎn)奶量數(shù)據(jù)進(jìn) 行數(shù)據(jù)分析，獲得與水牛產(chǎn)奶量顯著相關(guān)的分子標(biāo)記。
[0015] 本發(fā)明水牛產(chǎn)奶性狀基因 Leptin作為分子標(biāo)記的應(yīng)用，具體步驟如下：
[0016] (1)對待選育水牛進(jìn)行靜脈采集提取總DNA;
[0017] (2)針對核巧酸序列沈Q ID N0:1的第3683bp處的G3683-T3683 SNP位點(diǎn)，采用高 分辨率溶解曲線化RM)技術(shù)檢測上述步驟（1)中所述的DNA樣本進(jìn)行基因分型，得出GT基因 型的水牛作為本發(fā)明所需的選育奶水牛。本發(fā)明為水牛分子標(biāo)記輔助育種提供了新的分子 標(biāo)記。
[0018] 所述的分子標(biāo)記為水牛產(chǎn)奶性狀的遺傳標(biāo)記。
[0019] 所述的應(yīng)用為奶水牛的早期選育。
[0020] 該水牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)基因 Leptin作為分子標(biāo)記的方法及其應(yīng)用。
[0021 ]綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：
[0022] 1、提供了一種水牛泌乳相關(guān)基因 Leptin作為分子標(biāo)記方法；
[0023] 2、為提高奶水牛產(chǎn)奶量生產(chǎn)性能，選育具有高產(chǎn)奶量的優(yōu)良的奶水牛品種提供技 術(shù)支撐和奠定理論基礎(chǔ)。
[0024] 對本發(fā)明更詳細(xì)描述可參見實(shí)例部分。 【【附圖說明】】
[0025] 圖1為SNP分型結(jié)果展示。 【【具體實(shí)施方式】】
[0026] 下面的實(shí)施例可W幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不可任何 方式限制本發(fā)明。
[0027] 實(shí)施例1:水?；蚪M總DNA的制備
[002引采用血液基因組DNA提取試劑盒制備水?；蚪M總DNA(天根，北京），具體操作步 驟如下：
[0029] 1、取全血500化置于1 . 5mL離屯、管，加入等體積的細(xì)胞裂解液化，顛倒混勻， 1200化pm離屯、Imin，吸取上清，留下沉淀;加入等體積的細(xì)胞裂解液化，重復(fù)此步驟一次;加 入化L RNAase(100mg/mL)，振蕩 15sec，室溫靜置5min;
[0030] 2、加入20化Proteinase K溶液，混勻，加入20化L緩沖液GB，充分顛倒混勻，56°C 放置lOmin，期間顛倒混勻數(shù)次，溶液應(yīng)變清亮；
[0031] 3、加入2(K)yL無水乙醇，充分顛倒混勻;此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀；
[0032] 4、將上述所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收集管 中），12，000巧m離屯、Imin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
[0033] 5、向吸附柱CB3中加入500化緩沖液GD，12，OOOrpm離屯、Imin，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱CB3放入收集管中；
[0034] 6、向吸附柱CB3中加入600化漂洗液PW，12，00化pm離屯、Imin，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱CB3放入收集管中；重復(fù)此操作一次；
[0035] 7、12,00化pm離屯、2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，W徹底驚干 吸附材料中殘余的漂洗液；
[0036] 8、將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入1.5mL離屯、管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-200化洗脫緩 沖液TB，室溫放置2-5min，12，000巧m離屯、2min，將溶液收集到離屯、管中；
[0037] 9、存放于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0038] 實(shí)施例2:水牛產(chǎn)奶性狀Leptin基因分子標(biāo)記的獲取
[0039] 1、引物設(shè)計(jì)：WSEQ NO: 1為模板，利用Primers . 0引物設(shè)計(jì)軟件，經(jīng)01 igo軟件檢 巧。，確定用于擴(kuò)增水牛Leptin基因的正方向引物，并委托大連寶生物技術(shù)有限公司合成，其 中用于擴(kuò)增所述基因的正反向引物的DNA序列如SEQ ID N0:2-3所示。
[0040] 2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0041 ] 隨機(jī)選擇50頭水?；蚪MDNA樣本進(jìn)行混池，W作為PCR反應(yīng)的模板。
[0042] (l)PCR反應(yīng):反應(yīng)總體積為40yL，其中水牛DNA混合池模板化L，10X LA Taq Mix20 化，引物混合物（1〇111]\16曰油）2化和(1地20 1化1^。
[0043] (2)PCR反應(yīng)程序:94°C/3min; 94°C/30sec，60°C/30sec，72°C/1.5min，30個循環(huán)； 72DC10min;4°C 保存
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