。
[0054]圖7是示出多通道型平面膜片鉗裝置的閥(10)的控制系統(tǒng)的結構的一例的概念圖。
[0055]圖8(a)示出利用圖5所示的復合多通道型平面膜片鉗裝置(Ib)的20個通道內的I個通道進行的Ca2+成像的圖像。圖8(b)是示出在對圖8(a)所示的細胞I進行兩次電流注入時，將在圖8(a)所示的細胞I?4中觀察到的動作電位Ca2+成像化而得到的熒光強度的時間變化的圖表。
[0056]圖9是示出使用了圖5所示的復合多通道型平面膜片鉗裝置(Ib)得到的通道視紫質發(fā)現(xiàn)細胞中的通道電流的時間變化的圖表。
[0057]圖10是通過光學顯微鏡觀測在細胞固定位置配置神經(jīng)元而形成神經(jīng)網(wǎng)的情況的照片。
[0058]圖1lA示出在配置于貫通孔的神經(jīng)元開設小孔而形成全細胞(whole-cell)模式的情況下，根據(jù)外加膜電位相應地產(chǎn)生的通道電流。NoNT-n30表示在不添加煙酸且未成為全細胞模式的情況下的通道電流，且表示在該情況下幾乎不產(chǎn)生電流變化的情況。
[0059]圖1lB示出添加了谷氨酸的情況下的根據(jù)外加膜電位相應地產(chǎn)生的通道電流。
[0060]圖1lC示出在添加谷氨酸后添加AMPA受體拮抗物以及NMDA受體拮抗物的情況下的通道電流。
[0061]圖12是著眼于圖11的外加膜電位_20mV的通道電流，計算所觀測到的一個一個的脈沖狀波形的面積并圖表化而成的圖(圖12(a)?(C))。橫軸是各脈沖的面積，縱軸是規(guī)定的面積的脈沖的數(shù)量。在圖12(d)中示出通道電流脈沖的總和。
[0062]圖13是示出所形成的神經(jīng)網(wǎng)中的Ca2+成像的結果的照片。圖13(a)是在未添加狀態(tài)下進行Ca2+成像計量的結果，圖13(b)是在之后添加了加入ΙΟμΜ濃度的谷氨酸的緩沖溶液(500yL)的狀態(tài)下進行Ca2+成像的結果，圖13 (c)是在添加谷氨酸之后添加了 2.5mM的D-AP5以及2.5mM的CNQX的狀態(tài)下進行Ca2+成像的結果。
【具體實施方式】
[0063][概要]
[0064]本發(fā)明的平面膜片鉗裝置具有如下結構:在與基板的細胞配置面相反的一側的貯液部和電極部之間的流路上配置有閥(優(yōu)選為微型閥)，通過該閥來控制電解液的流通以及電導通的允許/停止。在平面膜片鉗裝置中，在每個單一通道裝置設置有由送液流路以及排液流路構成的一對流路。
[0065]本發(fā)明的發(fā)明人等發(fā)現(xiàn):通過在送液流路以及/或者排液流路上設置閥，優(yōu)選為微型閥，能夠在不大幅改變整體的動作時間的情況下使電極部共用化，實現(xiàn)裝置的小型化以及維護操作的簡化/縮短。
[0066]S卩，微型閥開閉微型流路所需的時間通常為幾秒以下。另外，在記錄來自電極的通道電流時，從某一通道向其他通道切換時的電路的響應速度通常為微秒級別，非常快。本發(fā)明人等著眼于這些方面而提出了如下結構:將與多個(例如η個)單一通道裝置連接的多個(例如η個)送液支流路以及排液流路分別與一個送液主流路以及排液主流路連結，并且以與送液主流路以及/或者排液主流路內的溶液導通的方式設置單一的電極，通過微型閥僅使成為測定對象的單一通道裝置的送液支流路以及/或者排液支流路微型閥處于打開狀態(tài)進行測定。
[0067]通過這種結構，能夠在不大幅改變整體的動作時間的情況下減少電極的數(shù)量(例如減至I/η)。另外，由于微型閥比電極小很多，因此裝置整體的尺寸也能夠大幅小型化。
[0068][單一通道型膜片鉗裝置]
[0069]首先，對單一通道型的平面膜片鉗裝置(酌情簡稱為“單一通道裝置”。)進行說明。單一通道裝置是具有能夠通過平面膜片鉗法進行測定的單一的構造單位(這里將其稱作“通道”)的裝置。
[0070]在圖1中示出本發(fā)明的一實施方式的單一通道型平面膜片鉗裝置(單一通道裝置)(I)的示意剖視圖。但是，本發(fā)明的平面膜片鉗裝置不限于圖1的單一通道裝置(I)。
[0071]圖1的單一通道裝置(I)具有包括第一表面(2S)以及第二表面(2S')的電絕緣性基板(2)。在電絕緣性基板(2)的第一表面(2S)配置有細胞配置區(qū)域(4)，在細胞配置區(qū)域(4)內設置有將第一表面(2S)與第二表面(2SQ連通的貫通孔(3)。該貫通孔(3)的大小設定為不使配置于細胞配置區(qū)域(4)的細胞(5)通過但液體能夠通過的大小。因此，貫通孔(3)的內徑只需根據(jù)所使用的細胞(5)的大小適當?shù)剡x擇即可。例如，從使用神經(jīng)元的觀點出發(fā)，優(yōu)選貫通孔(3)的內徑為I?3μπι左右，但不限于此。
[0072]電絕緣性基板(2)的材料也不受限制。作為一例，能夠任意地選擇玻璃制、陶瓷制、塑料制等的基板。但是，從進行來自下表面的激光的照射、基于顯微鏡的觀察的觀點出發(fā)，優(yōu)選為透明基板。另外，電絕緣性基板(2)可以由單一材料形成，也可以通過混合或者層疊多個材料而形成。作為一例，在使用硅基板的情況下，優(yōu)選為具有依次層疊第一表面(2S)側的娃層、中間的氧化娃層、第二表面(2S,)側的娃層的結構的娃基板(SOI (Silicon onInsulator)基板)。在這樣的層疊結構的娃基板中，由于在兩個娃層之間存在絕緣性非常高的中間層，因此能夠在測定對象細胞(5)的離子通道關閉時確保高電阻狀態(tài)，能夠減少背景的干擾。
[0073]在使用SOI基板的情況下，從減少寄生電容和絕緣電阻增大的觀點出發(fā)，優(yōu)選中間層的厚度較厚。另外，若中間層的厚度不足，則有時電容變大，電阻變低，導致干擾增大。因此，中間層的厚度例如優(yōu)選為5nm以上，其中更優(yōu)選為1nm以上，進一步優(yōu)選為10nm以上。另一方面，若中間層過厚，則有時不容易進行鉆孔加工。從這些觀點出發(fā)，中間層的厚度優(yōu)選為ΙΟμπι以下，更優(yōu)選為Ιμπι以下，進一步優(yōu)選為500nm以下。
[0074]另外，優(yōu)選為，在基板(2)表面的貫通孔(3)周邊部涂覆細胞(5)在固體表面生存所需的細胞外基質形成物質，并在該細胞外基質形成物質之上配置細胞(5)。由此，能夠一邊培養(yǎng)細胞(5) —邊持續(xù)/長期地測定該細胞的通道離子電流。對于使用該細胞外基質形成物質的培養(yǎng)型平面膜片鉗法的詳細情況，參照本發(fā)明的發(fā)明人等的日本特開2009-204407號公報(專利文南犬3)以及Urisu et al.,Analytical and B1analytical Chemistry ,(2008)，391:2703-2709(非專利文獻I)。作為所使用的細胞外基質形成物質，例示了聚賴氨酸、膠原(I型、II型、IV型)、纖維連接蛋白、層粘連蛋白，蛋白多糖(聚糖、核心蛋白聚糖等)、蛋白多糖(聚集蛋白聚糖)、連接蛋白、巢蛋白、肌腱蛋白、蛋白多糖[硫酸軟骨素蛋白多糖、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(珍珠糖等)、硫酸角質素蛋白多糖、硫酸皮膚素蛋白多糖]、透明質酸(糖胺聚糖的一種)、彈性蛋白、纖維蛋白等，但不限于它們。
[0075]另外，優(yōu)選為，在基板(2)表面的貫通孔(3)周邊部，形成由突起部(參照在后述的[復合多通道型平面膜片鉗裝置]中說明的圖6的附圖標記(25))圍成的細胞固定位置。由此，特別是在以神經(jīng)元為測定對象的情況下，能夠在限制神經(jīng)元的移動的同時構成神經(jīng)網(wǎng)。對于使用由該突起部(25)圍成的細胞固定位置的平面膜片鉗法的詳細情況，參照本發(fā)明人等的國際專利申請第PCT/JP2013/57976號(W02014/045618)。具體而言，能夠在基板表面上的貫通孔(3)的周圍設置多個、例如3、4、5、6、或者以上的突起部(25)來阻礙細胞(5)的移動。在上述突起部(25)之間，在不使神經(jīng)元的細胞體通過的限度內設置有較寬的間隔，并且，通過多個突起部(25)限定的細胞固定位置的內徑為能夠收容I?9個、優(yōu)選為I?5個神經(jīng)元的細胞體的尺寸。也可以代替突起部(25)而形成具有比細胞(5)大的寬度和深度的凹部，設為細胞固定位置。此外，通過利用具有比細胞體小的寬度的槽將上述多個凹部相互連接，能夠在限制神經(jīng)元的移動的同時構成神經(jīng)網(wǎng)。
[0076]在電絕緣性基板(2)的第一表面(2S)側，以能夠與貫通孔(3)連通的方式設置有第一貯液部(6)。在第一貯液部(6)中，保持有填充至配置于細胞配置區(qū)域(4)的細胞(5)的周圍的第一導電性液體(例如被稱作巴斯溶液的緩沖液、培養(yǎng)液等)。第一貯液部(6)例如具有主貯液部(6a)與副貯液部(6b)經(jīng)由導入用通液路(6c)而電連通的結構。在第一貯液部(6)中，可以具有用于導入或排出導電性液體的通液路，或也可以具有能夠通過蓋構件(13)進行開閉的開口部。
[0077]第一導電性液體是能夠進行配置于細胞配置區(qū)域(4)的細胞(5)的培養(yǎng)、基于膜片鉗法的電信號的檢測的液體。例如，作為第一導電性液體，能夠使用細胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)細胞后，替換為用于進行基于膜片鉗的電信號的檢測的巴斯溶液而使用。另外，也可以不替換為巴斯溶液，而在細胞培養(yǎng)液的情況下直接進行膜片鉗。細胞培養(yǎng)液能夠根據(jù)細胞種類、分化階段而適當?shù)剡x擇任意的細胞培養(yǎng)液、分化誘導培養(yǎng)液。作為細胞培養(yǎng)液的例子，能夠使用在依格爾(Eagle)培養(yǎng)基、杜氏改良依格爾(Dulbecco’s modified Eagle’s)培養(yǎng)基(DMEM),Ham F10、F12培養(yǎng)基等基礎培養(yǎng)基中，加入鹽類、血清、抗生素、生長因子、微量營養(yǎng)素等添加劑而得到的培養(yǎng)基。也可以在細胞配置區(qū)域(4)播種干細胞，例如iPS細胞、ES細胞、神經(jīng)干細胞、以及分化過程中的細胞進行培養(yǎng)，向所希望的細胞、例如神經(jīng)元分化，在本發(fā)明的平面膜片鉗裝置中也可以進行電信號的檢測。在該情況下，干細胞培養(yǎng)液、分化誘導培養(yǎng)液、神經(jīng)元培養(yǎng)液可以是分別不同的培養(yǎng)液，能夠依次替換而使用。作為運動神經(jīng)元、膠質細胞的培養(yǎng)液，可以在上述的細胞培養(yǎng)液中添加維甲酸、音猬因子(Sonic hedgehog),cAMP等。作為微量營養(yǎng)素，也可以添加胰島素、轉鐵蛋白、類胰島素生長因子(IGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、培養(yǎng)膠質細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)作為生長因子。對于巴斯溶液而言，只要是膜片鉗法中使用的巴斯溶液，則可以為任意的溶液。為了對細胞施加刺激，或者為了能夠實現(xiàn)細胞的成像，有時在第一導電性液體中添加各種試劑。
[0078]另外，以經(jīng)由第一導電性液體與第一貯液部(6)電導通的方式配置第一電極部
(7)。該第一電極部(7)配置為插入到第一貯液部(6)(例如第一貯液部(6)的副貯液部(6b))內的第一導電性液體的狀態(tài)。另外，對第一電極部(7)施加接地電位，由此第一貯液部(6)內的第一導電性液體能夠維持為基準電位。
[0079]另一方面，在電絕緣性基板(2)的第二表面(2SQ側，以能夠與貫通孔(3)連通的方式設置有第二貯液部(6')。在第二貯液部(6')中保持有第二導電性液體。第二導電性液體是能夠進行細胞(5)的培養(yǎng)、基于膜片鉗法的電信號的檢測的液體。例如，作為第二導電性液體，能夠使用細胞培養(yǎng)液，也能夠在培養(yǎng)細胞(5)之后，替換為用于基于膜片鉗進行的電信號的檢測的移液管溶液等緩沖液。另外，由于貫通孔