吡啶并吡嗪類化合物、其制備方法及醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一系列吡啶并吡嗪化合物，這些化合物通過 激活細(xì)胞內(nèi)的核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號通路，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激系統(tǒng)對外來的氧化 和親電刺激進(jìn)行抵御，使細(xì)胞損傷的修復(fù)成為可能，可用于炎性疾病及相關(guān)疾病的治療和 癌癥化學(xué)預(yù)防。
【背景技術(shù)】
[0002] 核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)屬 于堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，相對分子量為66kD，可通過調(diào)控關(guān)鍵的細(xì)胞保護(hù)型蛋白實(shí)現(xiàn) 對體內(nèi)防御系統(tǒng)和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的精確調(diào)控，在細(xì)胞防御外界的氧化和親電刺激中扮演著重要 的作用。在正常的生理情況下，Nrf2在胞漿內(nèi)被持續(xù)的Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1 (Kelch-1 ike ECH-associated protein-1，Keapl)介導(dǎo)的泛素化降解，保持著低水平。當(dāng)受 到氧化或親電刺激時，Keapl上的半胱氨酸被氧化或烷基化，其構(gòu)象發(fā)生改變，從而不利于 Nrf2的泛素化降解，Nrf2胞漿含量得到累計(jì)，進(jìn)而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，引發(fā)抗氧應(yīng)激元件 (antioxidant response element，ARE)基因的表達(dá)，進(jìn)而表達(dá)下游細(xì)胞保護(hù)型蛋白，常見 的有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)、NAD(P)H醌氧化還原酶 1 (NAD (P)H: quinone oxidoreductase-l，NQ01)、血紅素氧合酶-1 (hemo oxygenase-1，H0_1)等。 因此，激活Keapl-Nrf2-ARE信號通路具有抗氧化應(yīng)激、抗炎等多種功能，使細(xì)胞損傷的修復(fù) 成為可能，已被認(rèn)為是一種重要的炎性疾病、癌癥化學(xué)預(yù)防的策略。癌癥的化學(xué)預(yù)防是指用 天然、合成或生物學(xué)試劑來逆轉(zhuǎn)、抑制或阻止初級癌變以及腫瘤細(xì)胞在癌癥中的發(fā)展，包括 促進(jìn)致癌物的排除、抑制炎癥和癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖、侵襲、血管生成等。
[0003] 針對Keapl-Nrf2-ARE信號通路，目前研究最為成熟的當(dāng)屬親電型Nrf2激活劑，它 們通過共價修飾Keap 1上的半胱氨酸的巰基，使得Nrf 2得以激活。以兩個最有名的藥物富馬 酸二甲酯和⑶D〇-Me為例，富馬酸二甲酯，2013年被Π )Α批準(zhǔn)為治療成人多發(fā)性硬化癥的一 線藥物，它和它的代謝產(chǎn)物富馬酸單甲酯已被證明可在體內(nèi)和體外有效激活Nrf2,使得神 經(jīng)元細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞可以抵抗氧化應(yīng)激所引起的細(xì)胞損傷和死亡。CDDO-Me，開始被用 于治療2型糖尿病引起的慢性腎病，但是由于增加了病人的心血管意外的風(fēng)險(xiǎn)而終止于臨 床3期，后來又發(fā)現(xiàn)其具有治療肺動脈高壓的作用，新的臨床2期試驗(yàn)已經(jīng)啟動。這兩個藥物 有一個共同的特點(diǎn):含有α，β-不飽和酮結(jié)構(gòu)，這種邁克爾受體結(jié)構(gòu)可以與Keapl的的半胱氨 酸發(fā)生共價反應(yīng)，使得Keap 1發(fā)生變構(gòu)，抑制了Nrf2的泛素化降解，進(jìn)而激活Nrf2。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明公開了一類Nrf2激活劑，其具有α，β-不飽和酮結(jié)構(gòu)，首次構(gòu)建了吡啶并吡 嗪類的化合物骨架，并引入一系列側(cè)鏈，合成了一系列衍生物。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明化合 物在ARE熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中可以激活Nrf2下游基因 ARE的活性，可以上調(diào)細(xì)胞保護(hù)型 蛋白H0-1和NQ01，且沒有細(xì)胞毒性，理化性質(zhì)測試表明本發(fā)明化合物的透膜性和溶解度良 好，因此，本發(fā)明的化合物有望開發(fā)成治療炎性疾病及相關(guān)疾病和癌癥化學(xué)預(yù)防藥物。
[0005] 本發(fā)明的吡啶并吡嗪類化合物具有通式I所示的結(jié)構(gòu)：
[0006]
[0007] 其中R代表&-C6直鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基、含有1個雙鍵的C3-C7環(huán)烯基、Y取代的含有 1-2個選自N、0、S的五元或六元雜環(huán)、Y取代的含有1-2個選自N、0、S的苯并雜環(huán)、萘基或Z取 代的苯基，其中，Y取代基選自Η、&-C4烷基、&-C4烷氧基、氨基、&-C4烷氨基或鹵素;Z取代基 選自H、&-C4烷基、&-C4烷氧基、鹵素、硝基、氨基、Q-C4烷氨基、酰胺基、羥基、苯基、嗎啉基 或哌啶基；
[0008] 其中Ar存在或者不存在，Ar代表0
[0009] R優(yōu)選代表正丙基、叔丁基、環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷、環(huán)己烷、環(huán)己-1-烯-1-基、呋 喃-2-基、噻吩-2-基、噻唑-2-基、吡啶-3-基、吡嗪-2-基、1H-吲哚-3-基、喹啉-3-基、5-氯噻 吩-2-基、5-甲基呋喃-2-基、苯并呋喃-2-基、苯基、萘-2-基、甲氧基取代的苯基、鹵素取代 的苯基、硝基取代的苯基、[1，1'_二苯]-4-基、4-嗎啉基苯基或苯并[d][l，3]二氧戊環(huán)-5- 基。
[0010] 本發(fā)明的化合物可以用下列制備方法得到：
[00111
[0012] 其中R定義同前。
[0013] 原料II與草酸二乙酯發(fā)生縮合反應(yīng)得到中間體III，反應(yīng)中還應(yīng)加入甲醇鈉，反應(yīng) 溶劑為甲醇，反應(yīng)溫度優(yōu)選70~90°C，反應(yīng)時間優(yōu)選3.5~4.5h。
[0014] 接著，目標(biāo)化合物由中間體III和商業(yè)購買或自己合成的原料IV發(fā)生環(huán)合反應(yīng)得 到，反應(yīng)中還應(yīng)加入醋酸，反應(yīng)溶劑為乙醇，反應(yīng)溫度優(yōu)選80~90°C，反應(yīng)時間優(yōu)選1.5~ 2.5h〇
[0015] 通式I的化合物可以采用常見的分離方法進(jìn)行純化，如重結(jié)晶、柱層析等。
[0016] 本發(fā)明也包括通式I化合物的水合物、立體異構(gòu)體、溶劑化物和藥學(xué)上可接受的鹽 等。它們具有與通式I化合物同樣的藥理活性。
[0017] 本發(fā)明所述的化合物可以添加藥學(xué)上可接受的載體制成常見的藥用制劑，如片 劑、膠囊、粉劑、糖漿、液劑、懸浮劑、針劑，可以加入香料、甜味劑、液體或固體填料或稀釋劑 等常用藥用輔料。
[0018] 本發(fā)明所述的化合物在臨床上的給藥方式可以采用口服、注射等方式。
[0019]本發(fā)明的化合物臨床所用劑量為O.Olmg~lOOOmg/天，也可根據(jù)病情的輕重或劑 型的不同偏離此范圍。
[0020] 本發(fā)明的化合物對Nrf2下游ARE基因具有激活活性;不存在細(xì)胞毒性作用，可以安 全用于腫瘤的化學(xué)預(yù)防階段;對細(xì)胞保護(hù)型蛋白H0-UNQ01具有誘導(dǎo)作用；具有較好的成藥 性參數(shù)，如透膜性等。
[0021] 下面是本發(fā)明化合物的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)和理化性質(zhì)測試實(shí)驗(yàn)及結(jié)果，該部分的化合物 代號所對應(yīng)的結(jié)構(gòu)式等同于實(shí)施例部分的代號所對應(yīng)的結(jié)構(gòu)式。
[0022] 一、ARE熒光素酶報(bào)告基因誘導(dǎo)性評價
[0023] ARE熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)方法:該實(shí)驗(yàn)使用HepG2-ARE-C8細(xì)胞，這是一個在ARE (Nrf2調(diào)節(jié)的二相酶啟動子處有一段共有的序列ARE)下游穩(wěn)轉(zhuǎn)入一段熒光素酶報(bào)告基因的 細(xì)胞株，只要化合物對細(xì)胞內(nèi)的ARE有激活作用，那么它也將激活熒光素酶，熒光素酶催化 熒光素底物氧化反應(yīng)產(chǎn)生光能從而被機(jī)器捕捉到，通過檢測光強(qiáng)度來檢測化合物的誘導(dǎo)性 強(qiáng)弱。具體的實(shí)驗(yàn)方法為:在96孔板中以4 X 105/mL接種細(xì)胞，每孔100yL，培養(yǎng)過夜，本發(fā)明 的化合物和陽性參照化合物分別配制相應(yīng)濃度，加入96孔板，每孔100yL，設(shè)三復(fù)孔，作用 12h后，吸出培養(yǎng)基并用roS漂洗細(xì)胞，每孔加入30yL IX裂解緩沖液，冰上裂解15min，吸取 20yL上清液，使用luminoskan ascent(Thermo scientific，USA)檢測，檢測時每孔加入 100 yL熒光素酶檢測試劑，立即讀數(shù)，最后測得的數(shù)據(jù)與影響參照DMS0組相除得到比值，比值越 大，說明誘導(dǎo)性越好。實(shí)驗(yàn)中以tBHQ組和SFN組為陽性對照，DMS0組為陰性對照，細(xì)胞培養(yǎng)裂 解試劑作為背景值。
[0024]其中，tBHQ是特丁基對苯二酚，其在體內(nèi)可被氧化為含有α，β-不飽和酮的結(jié)構(gòu)，進(jìn) 而發(fā)揮Nrf2激活作用。SFN是異硫氰酸酯類Nrf2激活劑的代表。它們是目前針對Nrf2靶點(diǎn)最 常用的溫和的ARE熒光素酶基因的陽性參照。各個化合物對ARE基因的誘導(dǎo)情況如表1所示。
[0025 ]表1本發(fā)明代表化合物對ARE焚光素酶報(bào)告基因的誘導(dǎo)情況 [0026]

[0027] 由表1可以看出本發(fā)明化合物可以顯著激活Nrf2下游的ARE基因，在1 ΟμΜ濃度下， 對ARE基因的誘導(dǎo)倍數(shù)幾乎均高于常見的Nrf2激活劑的對照物tBHQ。
[0028] 二、細(xì)胞毒性評價
[0029] 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法:MTT染色法，噻唑蘭(Me thy lthiazolyl diphenyl-tetrazolium bromide，MTT)，也稱作溴化噻唑藍(lán)四氮唑，是一種可接受氫離子的化合物染料，帶正電荷， 具有細(xì)胞膜滲透性?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠催M(jìn)入的MTT還原成為水不 溶性的深藍(lán)色MTT-甲臜結(jié)晶，而死細(xì)胞不具有此功能。甲臜結(jié)晶是不能穿透細(xì)胞膜，因此 沉積在處于增殖且未受損傷的細(xì)胞內(nèi)。甲臜結(jié)晶可用DMS0溶解出來，酶標(biāo)儀下測定562nm的 吸光度反映甲臜的生成量，而甲臜的生成量與活細(xì)胞數(shù)目成正比，用以評估細(xì)胞存活狀況， 因此檢測光密度值(0D值)越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。具體的實(shí)驗(yàn)方法為:在96孔板中以8X10 4/ mL接種，每孔100yL，培養(yǎng)過夜，本發(fā)明的化合物配制相應(yīng)濃度，每孔100yL，設(shè)六個濃度梯 度，每個濃度設(shè)三個復(fù)孔，作用24h后，每孔加入20yL PBS配置的5mg/mL的MTT溶液，37°C孵 箱放置4h，除去所有液體，每孔加入150yL DMS0，在震蕩儀上震蕩10min，用酶標(biāo)儀在波長 562nm下檢測光密度值(0D)。以含細(xì)胞和DMS0的孔為陰性對照，以只含培養(yǎng)基的孔為空白對 照。各個化合物的細(xì)胞毒性結(jié)果如表2所示。
[0030] %抑制率=1 -(化合物孔0D值-空白孔0D值)/ (陰性孔0D值-空白孔0D值）
[0031 ] 用Graphpad Prism 5軟件處理，計(jì)算化合物的IC50。
[0032]表2本發(fā)明代表化合物的細(xì)胞毒性評價
[0033]
[0034]
[0035] 由表2可以看出本發(fā)明部分化合物IC5Q幾乎都在100μΜ以上，無細(xì)胞毒性，可以安全 用于腫瘤的的預(yù)防階段，而且也可以用于佐證上述的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的活性沒有受 到細(xì)胞損傷所造成的影響。
[0036] 三、Western Blot檢測化合物對目的蛋白的影響
[0037]實(shí)驗(yàn)方法:蛋白免疫印跡Western Blot，將細(xì)胞接種于細(xì)胞瓶內(nèi)，孵育過夜，將不 同濃度的化合物加入的細(xì)胞瓶中，作用8h或者24h后，收集細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞 破碎提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制作實(shí)驗(yàn)所需蛋白樣品，依次進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳， 轉(zhuǎn)膜，封閉，分別對目的條帶進(jìn)行一抗4°C孵育過夜，TBS緩沖液洗滌，二抗室溫孵育2h，應(yīng)用 Odyssey Infrared Imaging System進(jìn)行目的條帶檢測。H0-1和NQ01是Nrf2下游研究最多 的細(xì)胞保護(hù)蛋白，作為本次實(shí)驗(yàn)的目的蛋白進(jìn)行檢測。
[0038]化合物對H0-1和NQ01表達(dá)水平的影響情況見圖1.
[0039]由圖1可以看出化合物3 g可以明顯的上調(diào)H0-1和NQ01的表達(dá)水平，對NQ01的影響 比HO-1明顯，在50μΜ時，對HO-1的上調(diào)作用開始顯現(xiàn)，在10 ΟμΜ時，對NQO1的上調(diào)作用優(yōu)于陽 性參照tBHQ;化合物2c也可以上調(diào)NQ01的表達(dá)水平，50μΜ時，NQ01的上調(diào)效果明顯。
[0040]四、化合物的理化性質(zhì)測試
[0041 ]化合物的解離常數(shù)(pKa)、脂水分布系數(shù)(LogD，pH = 7.4)是根據(jù)經(jīng)典的Avdeef-Bucher電位滴定的方法在