馬拉巴石斑魚Piscidin的改造體抗菌肽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種抗菌肽及其應用。
【背景技術】
[0002] 現(xiàn)行化學藥劑和抗生素的濫用和大劑量，很容易使耐藥性菌株日益增多，菌群 失調和醫(yī)院交叉感染等已成為現(xiàn)時醫(yī)院中急待解決的一大難題，嚴重危害著人類的健 康。環(huán)境惡化以及溫室效應也加速了抗藥性和抗疫苗的病原體菌株的進化（Peneau et al.，2007)，而抗菌肽的發(fā)現(xiàn)為解決這些難題提供了新的方向。抗菌肽是一類具有廣譜抗 微生物活性的小分子多肽，廣泛存在于生物界中，是先天性免疫系統(tǒng)中重要的非特異性免 疫因子?？咕木哂蟹肿恿啃?，熱穩(wěn)定和水溶性好等特點，其作用機理不同于傳統(tǒng)抗生素， 使用后對細菌不易產生耐藥性，并且抗菌肽進入機體后代謝速度非?？?，不會在機體中產 生有害殘留。由于抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對細菌具有很強的殺滅作用，而且還能夠殺 滅對抗生素產生耐藥性的病原體，另外有報道指出抗菌肽對真菌、病毒、原生動物甚至腫 瘤都具有殺傷作用。因此，抗菌肽有望開發(fā)成為一類新型高效抗菌藥物或輔助治療藥物， 在臨床醫(yī)學、食品及化妝品防腐、飼料添加劑等領域具有廣闊的開發(fā)應用前景（Thomas et al. , 1996 ；Alexandra et al. , 2006 ；Dong et al 2012)〇〇
[0003] 但是，另一方面，盡管抗菌肽對微生物細胞膜的作用具有選擇性，而體外試驗發(fā) 現(xiàn)較高濃度的抗菌肽也會破壞真核細胞，包括對紅細胞的溶血作用、對淋巴細胞等的破壞 等（Sun et al.，2006)。因此，發(fā)掘自然界中高效、新型的抗菌肽是人們關注的一方面，同時 人們還關注對自然抗菌肽的改造，以期提高抗菌肽抗菌活性的同時降低其對機體本身的毒 性，這已成為抗菌肽研究中的新熱點。
[0004] 細胞選擇性是指抗菌肽對不同細胞的生物學活性不同?？咕氖杷院碗姾尚詫?抗菌肽的細胞選擇性影響很大（Ma et al.，2011)。早期研究主要是通過特定的氨基酸替 換以提高抗菌肽螺旋度，從而提高抗菌肽對細胞膜的親合力，提高抗菌活性。Zhu等（Zhu et al.，2006)使用N-取代甘氨酸類酸性化合物N-trp替代風毒素 Melittin (ME)第19位 Trp，合成了螺旋含量低于Melittin的類似物ME-w。實驗顯示，ME-w與ME雖然對6中測試 細菌和白假絲酵母的抗菌性基本相同，單對膜呈電中性的hRBC、HeLas和NIH-3T3細胞的毒 性大大降低。
[0005] 也有研究者發(fā)現(xiàn)，用D-型氨基酸替代肽v681的11位和13位L一型氨基酸獲得一 系列V681的衍生肽，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)D-型氨基酸衍生肽比其原型氨基酸肽的抗菌活性更高，但 是溶血活性很高，并因此認為高螺旋度是其具有溶血性的原因之一（Chen et al.，2005)。 其后，Chen等報道用D型氨基酸替換其同分異構體L型氨基酸，小利于肽鏈螺旋形成，降 低螺旋含量，同時并不改變其凈電荷數(shù)和疏水性，足以提供研究抗菌肽螺旋度與抗菌活性 和溶血活性關系的有效方法（馬清泉等，2011)。最近研究顯示，LK替代的多肽序列在 64 μ mol/L時引起50%的人血細胞發(fā)生溶血（王良等，2014)，而馬清泉等設計的VGR16在 256 μ mol/L時仍然沒有溶血活性（馬清泉等2011)，這表明V的替換在降低抗菌肽溶血活 性方面具有重要的應用價值。
[0006] 另外，Zhao等（2013)通過對多肽Bac2A的改造驗證顯示，可以根據(jù)不同細胞膜的 磷脂雙分子層中不同磷脂的比例，以及氨基酸的能量從而決定不同的氨基酸需要在不同的 位置就能達到定向的改變目的，其中氨基酸W，R被其強調效果尤為明顯，但是也只能說明 在Bac2 (ARLARIVVIRVAR-NH2)這個短的多肽序列可能比較合適，但是其改造 Bac2庫也只有 約22%出現(xiàn)了能夠降低溶血活性的現(xiàn)象，所以也只能說是驗證了 W、R氨基酸可能有一定的 降低溶血活性的功能，真正定向的改變多肽的部分功能尚未成熟，仍為大家在努力探索的 方向。
[0007] 可見，具有a-螺旋式類抗菌肽功能有效的的結構基礎，適宜的兩親性和正電荷 數(shù)可能是其具備高抗菌活性和低溶血性的關鍵。正電荷過高會阻礙抗菌肽穿膜孔道的形 成；高疏水性和螺旋度是α-螺旋抗菌肽具溶血性的主要原因。在分子設計中須綜合考慮 螺旋度、兩親性、疏水性和凈正電荷等結構參數(shù)，既要遵守共性原則也要考慮各自特殊性的 要求。
[0008] Silphaduang等（2001)首次從海洋魚類雜交條紋S盧（M. chrysops X M. saxatilis)肥大細胞中分離出Piscidin,發(fā)現(xiàn)該抗菌肽對魚類的幾種病原菌最小抑制 濃度低達1.2ymol/L。隨后人們發(fā)現(xiàn)Piscidin具有廣譜的抗菌活性，而且對病毒、真菌乃 至寄生蟲也均有一定的抑制作用（Noga et al.，2003 ;Noga et al.，2009)。近十年的研究 表明，piscidins是魚類特有的一個抗菌肽家族，并廣泛存在于鱸形目、鱈形目等魚類中， 是一類線性、兩親性、具有典型α螺旋結構的小分子陽離子抗微生物多肽，抗菌譜廣、殺菌 能力強，并具有抗病毒甚至抗寄生蟲等活性（Silphaduang et al.，2006)。
[0009] 發(fā)明人前期研究顯示，從馬拉巴石斑魚（Epinephelus malabaricus)中獲得的 Piscidin 基因（GenBank:JX412480)，其 mRNA 編碼的氨基酸序列為（MRCIALFLVLSLVVLMA EPGEGFFFHIIKGLFHAGRMIHGLVNRRRHRH GMEELDLDQRAFEREKAFA)。通過合成其預測成熟肽 (FFFHIIKGLFHAGRMIHGLV)，抑菌實驗表明具有極強的殺菌活性，但同時具有較高的溶血活 性。因此該抗菌肽是非常值得改造的目標抗菌肽。該序列原始是從馬拉巴石斑魚克隆得出 的多肽，因此可以將其視為天然肽Piscidin,簡寫為emPis-wt。根據(jù)piscidin本身的親水 性疏水性與抗菌活性、溶血活性的矛盾關系，需要推測出適當?shù)慕档投嚯男蛄械氖杷栽?強其親水性，同時能夠保持其高性能的殺菌活性，究竟應該怎樣去降低怎樣去改變，這沒有 成熟的方案，沒有固定的原則，這無疑增強了改造的困難性。
[0010] 雖然有報道指出，κ是帶有正電荷的氨基酸，使得肽帶有凈正電荷，它可與細菌表 面帶有負電荷的脂多糖發(fā)生靜電吸引作用，使抗菌肽吸附在細菌表面；L是疏水性殘基，使 得肽具有很強的疏水性，它可滲入脂質雙分子層破壞細胞膜的結構，改變細胞的滲透性，進 而發(fā)揮殺菌作用（Teixeira V，et al，2012)但是，究竟應該將K替代在什么位置，是不是替 代的越多就越好，這也是存在很多不確定因素。
[0011] 另外，雖然很多人嘗試選擇用D型氨基酸提高多肽的活性，但是也存在著一些問 題：第一，合成的成本太高；第二，與天然存在的多肽為L型不符合，這無疑會為后續(xù)實驗及 將來的大規(guī)模生產、應用造成一定的困難。于是本發(fā)明著手既能夠在既符合天然存在規(guī)律， 又實現(xiàn)多肽的改造，保持高的抑菌活性，同時極為顯著地降低了溶血活性和細胞毒性，這無 疑將為未來抗菌肽的規(guī)?；?、產業(yè)化應用提供無可比擬的價值。

【發(fā)明內容】

[0012] 本發(fā)明的一個目的是提供一種馬拉巴石斑魚piscidin的改造體抗菌肽。
[0013] 本發(fā)明的另一個目的在于提供編碼所述改造體抗菌肽的基因。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種含有上述編碼改造體抗菌肽基因的重組表 達載體。
[0015] 本發(fā)明的也提供所述馬拉巴石斑魚piscidin的改造體抗菌肽的應用。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明通過將從馬拉巴石斑魚（Epin印helus malabaricus)中獲得的 Piscidin 基因（GenBank: JX412480)，其 mRNA 編碼的氨基酸 序列如 SEQ IDN0. 5 所示(MRCIALFLVLSLVVLMAEPGEGFFFHIIKGLFHAGRMIHGLVNRRRHRHGM EELDLDQRAFEREKAFA)，通過合成其預測成熟肽為：FFFHIIKGLFHAGRMIHGLV，經改造獲得人工 肽（pisL9K22WK)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，包含23個氨基酸其等電點、相對分子 質量為Pl/Mw: 11. 26/2801. 46,并經抑菌實驗證明經改造的人工肽具有與天然抑菌肽相近 的抑菌活性，且溶血活性和細胞毒性大大降低。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，針對不同的表達系統(tǒng)，對編碼上述改造體抗菌肽的基因 序列進行了密碼子優(yōu)化，其中適于在衣藻中表達的編碼本發(fā)明抗菌肽的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示，適于在酵母中表達的編碼本發(fā)明抗菌肽的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示， 適于在大腸桿菌中表達的編碼本發(fā)明抗菌肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，含有上述編碼改造體抗菌肽基因的表達載體優(yōu)選為衣 藻、酵母或大腸桿菌表達載體。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明的改造體抗菌肽可應用于動物飼料、藥物等領域。
[0020] 本發(fā)明的馬拉巴石斑魚piscidin的改造體抗菌肽保持了與天然抗菌肽piscidin 相接近的殺菌活性的同時，顯著降低了溶血活性以及細胞毒性，具有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0021] 圖1為三條改造的多肽與emPis-wt的氨基酸序列對比；
[0022] 圖2為emPis-wt及3條改造肽的疏水性分析，其中a為emPis_wt，b為pisL9K20， c 為 pisL9K22TG，d 為 pis L9K22WK ;
[0023] 圖3為emPis-wt及3條改造肽的螺旋輪圖，其中a為emPis-wt，b為pisL9K20，c 為 pisL9K22TG，d 為 pis L9K22WK ;
[0024] 圖4為emPis-wt及3條改造肽的二級結構預測，其中a為emPis-wt, b為 pisL9K20, c 為 pisL9K22TG，d 為 pis L9K22WK ;
[0025] 圖5為pisL9K20氨基酸序列在NCBI庫同源性對比；
[0026] 圖6為pisL9K22TG氨基酸序列在NCBI庫同源性對比；
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