一種具有體內抗氧化活性的點柄粘蓋牛肝菌子實體多糖及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬食用菌資源開發(fā)領域，具體涉及一種具有體內抗氧化活性的點柄粘蓋牛 肝菌子實體多糖SGPII-b及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 點柄粘蓋牛肝菌[Suillus granulatus(L. :Fr. )0.Kuntce]又名黃花松鸞、栗殼 牛肝菌，在真菌分類上屬于真菌門、擔子菌綱、傘菌目、牛肝菌科、粘蓋牛肝菌屬。點柄粘蓋 牛肝菌是一種食藥兼用野生食用菌，是東北地區(qū)重要的野生食用菌之一。點柄粘蓋牛肝菌 味道鮮美，兼具有的抗腫瘤、抗氧化、提高人體免疫力等功效。這些功效來源于多種生理活 性物質，如多糖、維生素、礦物質等，其中以多糖成分最為重點。
[0003] 生物機體內存在多種自由基，大都以活性氧形式存在?？蓪C體細胞進行攻擊，使 機體各系統(tǒng)功能出現(xiàn)紊亂進一步傷害體內組織。目前已有很多疾病被認為是自由基過量引 起的。如高脂血癥、免疫力低下、類風濕性關節(jié)炎以及急性呼吸窘迫綜合癥等。另一方面也 被認為是基是促進機體衰老的主要因子。由于，因此能對自由基起清除作用和具有抗氧化 活性的物質越來越受到人們的關注。研究已證實許多食用菌多糖具有抗氧化活性，可對各 種自由基具有清除作用，能提高抗氧化酶(SOD)、GSH-Px等的活性，從而表現(xiàn)出抗氧化性能。 因此天然抗氧化劑一一食用菌多糖的研究和開發(fā)在醫(yī)藥保健和食品行業(yè)具有著寬闊的應 用前景。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術不足，提供一種操作簡單，收率高，具有明顯體內抗氧化 活性的點柄粘蓋牛肝菌子實體多糖及其制備方法。
[0005] 為解決上述技術問題，本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。
[0006] -種具有體內抗氧化活性的點柄粘蓋牛肝菌子實體多糖，其特征在于，源自點柄 粘蓋牛肝菌子實體，呈灰黃色粉末狀，分子量為25.2kDa;由鼠李糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖 及半乳糖5種單糖組成，按質量份計，其組成比例依次為：1:1.37:5.11:16.15:3.59。
[0007] 上述具有體內抗氧化活性的點柄粘蓋牛肝菌子實體多糖的制備方法，可按如下步 驟依次實施。
[0008] (1)點柄粘蓋牛肝菌子實體經清洗，晾干，粉碎后得提取原料。
[0009] ( 2)向提取原料中加入去離子水后，浸提;離心收集殘渣，再重復浸提，合并濾液得 到粗提液。
[0010] (3)粗提液經旋轉蒸發(fā)濃縮后，加入無水乙醇，攪拌產生沉淀，靜置，離心收集沉 淀，沉淀經無水乙醇和乙醚洗滌后得粗多糖CSGP。
[0011] (4)粗多糖CSGP溶于去離子水后加入Sevag試劑充分振蕩;離心去除蛋白層和氯仿 層;水層重復操作至不再出現(xiàn)蛋白層為止，所得水溶液經透析和冷凍干燥得到多糖SGP。
[0012] (5)將多糖SGP溶于去離子水中，先后用去離子水、0.5M NaCl和1.5M NaCl溶液進 行洗脫分級;收集1.5M NaCl的洗脫液;洗脫液經透析除鹽，冷凍干燥得多糖SGPII。
[0013] (6)將多糖SGPII溶于去離子水中進行洗脫分級；收集洗脫流出的第二個組分;收 集得到的組分經透析除鹽、冷凍干燥即得目的產物具有體內抗氧化活性的點柄粘蓋牛肝菌 子實體多糖SGPII-b。
[0014] 作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述步驟(2)中，向提取原料中加入20~40倍重量去離 子水后，80~100°C浸提2~4h。
[0015] 進一步地，本發(fā)明所述步驟(3)中，粗提液經旋轉蒸發(fā)濃縮后，加入3~5倍體積無 水乙醇，邊加邊緩慢攪拌產生沉淀，2~6°C靜置10~20h。
[0016] 進一步地，本發(fā)明所述步驟(1)中，點柄粘蓋牛肝菌子實體粉碎至40~100目。
[0017] 進一步地，本發(fā)明所述步驟(2)中，離心收集速度為3000~5000轉/分;離心20~30 分鐘。
[0018] 進一步地，本發(fā)明所述步驟(3)中，離心收集速度為10000~15000轉/分;離心20~ 30分鐘。
[0019] 進一步地，本發(fā)明所述步驟(4)中，Sevag試劑由正丁醇和氯仿按體積比1:4~5配 制；Sevag試劑的用量按多糖溶液體積的1:4~6加入;離心收集速度為3500~4500轉/分； 離心10~25分鐘。
[0020] 進一步地，本發(fā)明所述步驟(5)中，可采用DEAE-纖維素離子交換柱洗脫分級。
[0021] 進一步地，本發(fā)明所述步驟(6)中，可采用瓊脂糖凝膠CL-6B洗脫分級。
[0022] 點柄粘蓋牛肝菌子實體多糖的體內抗氧化實驗。
[0023] 動物模型的構建的原理是通過一定時間內給動物連續(xù)注射D-半乳糖，使細胞內半 乳糖濃度增高，在醛糖還原酶作用下，還原成半乳糖醇，后者不能被細胞進一步代謝而堆積 在細胞內，影響正常滲透壓，導致細胞腫脹，功能障礙，代謝紊亂；同時，D-半乳糖在體內氧 化時產生大量自由基，超過機體的清除能力，引發(fā)脂質過氧化的鏈式反應，最終機體衰老。 [0024] 60只昆明小鼠（2月齡;體重BW 20 ± 2g)中隨機分為6組，每組10只，包括正常組、模 型組、陽性對照組和3個多糖實驗組。正常組每天按10 mL/kg BW皮下注射生理鹽水;模型 組、陽性對照組和3個多糖實驗組每天均按100 mg/kg BW皮下注射D-半乳糖的生理鹽水溶 液，注射體積等同于正常組。陽性對照組每天采用胃管飼法給予100 mg/kg BW抗壞血酸，3 個多糖實驗組每天采用胃管飼法分別給予SGP ΙΙ-b劑量100,200,和400 mg/kg BW，連續(xù)給 藥40天后，小鼠禁食不禁水12h，眼球取血，4°C，4000r/min離心10分鐘，收集血清待測。取血 后小鼠頸椎脫臼處死取肝臟勻漿（lg肝臟加9mL生理鹽水)4°C，4000r/min離心10分鐘，分離 上清待測。分別測定血清和肝臟中的超氧化物歧化酶(S0D)活力、過氧化氫酶(CAT)活力、谷 胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力以及丙二醛(MDA)含量，上述檢測均采用南京建成生物工 程研究所生產的相應試劑盒進行檢測。實驗結果見表1和表2。
[0025] 表1點柄粘蓋牛肝菌子實體多糖對小鼠血清中SOD, CAT, GSH-Px和MDA水平 的影響。
[0026] 注：與模型組比較:*，ρ<0·05;**，ρ<0·01。
[0027] 表2點柄粘蓋牛肝菌子實體多糖對小鼠肝臟中SOD，CAT，GSH-Px和MDA水平 的影響。
[0028] 注：與模型組比較:*，ρ<0·05;**，ρ<0·01。
[0029] 由表1和表2可知，的模型組小鼠的血液和肝臟中的抗氧化酶（SOD，GSH-Px和CAT) 的活性與正常組相比均顯著的降低，MDA與正常組相比也明顯增加，說明衰老小鼠模型已成 功的構建。多糖實驗組的檢測結果顯示點柄粘蓋牛桿菌子實體多糖SGPII-b顯著地增加了 SOD，GSH-Px和CAT活力并顯著降低了MDA水平，其影響還表現(xiàn)為濃度依賴型。此外點柄粘蓋 牛桿菌子實體多糖SGPII-b表現(xiàn)出的影響與陽性對照組(抗壞血酸)相比較有著相似或更好 的結果。
【附圖說明】
[0030] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步說明。本發(fā)明的保護范圍不僅局 限于下列內容的表述。
[0031] 圖1為點柄粘蓋牛肝菌子實體多糖DEAE-纖維素離子交換層析圖。
[0032] 圖2為點柄粘蓋牛肝菌子實體多糖的瓊脂糖凝膠CL-6B層析圖。
[0033] 圖3為點柄粘蓋牛肝菌子實體多糖SGPII-b的單糖組成分析圖。
[0034]圖4為點柄粘蓋牛肝菌子實體多糖SGPII-b的HPLC圖。
【具體實施方式】 [0035] 實施例1。
[0036] 點柄粘蓋牛肝菌子實體多糖SGPII-b的制備。
[0037] (1)點柄粘蓋牛肝菌子實體經清洗，晾干，粉碎至80目，得提取原料。
[0038] (2)萃取提取原料1000g加入25L去離子水后，90°C浸提3h; 4000轉/分離心20分鐘 收集沉淀，沉淀再重復浸提，合并濾液得到粗提液。
[0039] (3)粗提液經旋轉蒸發(fā)濃縮