孢子化缺陷型德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌細(xì)胞及用于有效且劃算滅活和使用它們的方法
【專利說明】孢子化缺陷型德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌細(xì)胞及用于有效且劃 算滅活和使用它們的方法
[00011 本申請是基于申請日為2012年2月28日，優(yōu)先權(quán)日為2011年3月1日（US61/447， 703)和2012年2月27日（US 13/406，202)，申請?zhí)枮?01280020898.8，發(fā)明名稱為："孢子化 缺陷型德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌細(xì)胞及用于有效且劃算滅活和使用它們的方法"的專利申 請的分案申請。
[0002] 對相關(guān)申請的交叉引用
[0003] 本申請要求2011年3月1日提交的美國臨時申請No. 61 /447，703的權(quán)益，其完整內(nèi) 容通過提述并入。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明總體上涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌 (Brevibacillus texasporus)的脅迫敏感性或孢子化缺陷型菌株、用于德克薩斯側(cè)孢短芽 孢桿菌生物體的有效且劃算的細(xì)胞滅活的方法、及自這類菌株衍生的飼料或水添加劑。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 本文中引用的任何文件并非承認(rèn)該文件是現(xiàn)有技術(shù)或本文中任何權(quán)利要求的可 專利性的考慮材料，并且關(guān)于任何文件的內(nèi)容或日期的任何陳述均基于提交時該申請可用 的信息，而不構(gòu)成證實或承認(rèn)該陳述是正確的。
[0007] 健康動物或未被病原性生物體(如病原性細(xì)菌)感染的動物較快生長并且從每千 克飼料取得更多的體重增加。因此，自20世紀(jì)40年代以來，抗微生物化合物已被用作家畜中 的生長促進(jìn)劑。通常，抗微生物化合物被以亞治療劑量或低劑量在飼料中施用。
[0008] 盡管已長期使用亞治療劑量的抗微生物化合物來幫助家畜保持健康并更快生長， 但最近的報告顯示了抗生素的使用與從這些動物生產(chǎn)的肉類上藥物抗性細(xì)菌的存在之間 的聯(lián)系。因此，歐洲委員會、美國農(nóng)業(yè)部(USDA)以及美國食品和藥品管理局(FDA)均已制定 了關(guān)于將某些抗生素用作生長促進(jìn)劑的禁令和指南。目前，規(guī)則通常聚焦于與用于治療人 類的抗生素相同或類似的抗生素的使用。然而，對使用所有抗生素藥物來增強(qiáng)家畜生長的 總體性抵制日益增長。此外，有機(jī)生成肉類的市場正在擴(kuò)大，并且要得到有機(jī)認(rèn)證，美國肉 類必須來自未經(jīng)抗生素喂養(yǎng)的動物。因此，目前存在對用于家畜飼料的新型生長增強(qiáng)劑需 求。
[0009] 另外，伴侶動物健康是一個快速增長的市場。經(jīng)由刺激先天性免疫來保持伴侶動 物(例如老齡伴侶動物)的健康對于伴侶動物的保健是一種有吸引力的辦法，并且口服投遞 的免疫刺激劑會是高度有價值的。
[0010] 德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌(BT)(例如ATCC PTA-5854)是一種最近鑒定的土壤細(xì) 菌，其生成一組陽離子非核糖體肽(NRPS peptides)(參見W02005/074626和WU等2005)。這 些來自BT的陽離子肽在體外展現(xiàn)出廣譜抗細(xì)菌活性，其殺死革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌、真菌 和原生動物(W0 2005/074626)。
[0011] 盡管具有體外抗細(xì)菌活性，但BT肽似乎缺乏體內(nèi)抗細(xì)菌活性。萬古霉素抗性腸球 菌在體外對BT肽是高度敏感的。然而，BT肽在明顯超出最小抑制濃度的濃度不能使共生的 VRE自小鼠腸道去定殖化(decolonize)。
[0012] 然而，分離的肽被顯示了在被用作飼料添加劑時有效預(yù)防雞的大腸桿菌病和沙門 氏菌病。另外，還顯示了此分離后的肽在雞中有效促進(jìn)生長并提高飼料轉(zhuǎn)化。
[0013] 可能更重要地，BT肽的體內(nèi)作用似乎不依賴于其體外抗生素活性，因為它在低于 其體外最小抑制濃度的濃度時有效預(yù)防大腸桿菌和沙門氏菌對雞的感染(JIANG等2005; K0GUT等2007;K0GUT等2010)。還被注意到的是，在飼喂BT肽的雞中，血液異嗜白細(xì)胞 (heterophil)和單核細(xì)胞被預(yù)備活化(primed for activation)，這指向先天性免疫刺激 為可能的作用機(jī)理。這些特征使得BT肽成為家畜生產(chǎn)中理想的飼料添加劑和抗生素化合物 的替代品。
[0014] 另外，由于現(xiàn)在還已知先天性免疫在控制病毒性和真菌性感染以及預(yù)防非傳染病 (如肥胖/代謝綜合征和2型糖尿?。┲衅鹬P(guān)鍵作用(VIJAY-KUMAR等2010)，因此BT先天性 免疫調(diào)節(jié)劑也應(yīng)在這些治療領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用。
[0015] 然而，BT肽作為飼料添加劑的經(jīng)濟(jì)價值嚴(yán)重受限于肽分離的需要，其使生產(chǎn)成本 增加至其在經(jīng)濟(jì)上不再可行的程度。作為純化該肽的替代方案，有可能可以將整個生物體 (PTA-5854)(如在國際專利公開文本W(wǎng)0 2005/074626中討論的)直接用來生產(chǎn)飼料添加劑。
[0016] 通常，直接飼喂微生物(DFM)或益生菌(probiotic)菌株需要以活體形式和充足數(shù) 目到達(dá)腸道，這需要菌株在飼料加工和消化期間存活(參見美國專利5,480,641和美國專利 公開文本20040247568)。由于飼料顆粒生成通常牽涉足以顯著降低存活力的加熱，大多數(shù) 益生菌菌株都經(jīng)過目標(biāo)為其對加熱和胃中測出的pH條件的抗性的篩選。目前，最穩(wěn)定的益 生菌菌株是芽胞桿菌孢子，因為細(xì)菌孢子是熱抗性的，并且在長期貯存期間保持存活。
[0017] 然而，由于BT生物體不被認(rèn)為是通常在家畜腸道中找到的共生細(xì)菌，期望和/或有 必要的是在使用之前滅活其生物體。然而，在能生成孢子的菌株中，這是有問題的。另外，至 少一個政府管理機(jī)構(gòu)在評估涉及微生物來源的新飼料時考慮以下標(biāo)準(zhǔn):微生物生產(chǎn)的安全 性;微生物產(chǎn)品對人、動物和環(huán)境的安全性;橫向基因轉(zhuǎn)移的潛在影響；與胃腸微生物區(qū)系 的相互作用;在腸中的持久性；由于活體微生物灑落而對人和環(huán)境的潛在影響，尤其是在肉 類污染會被認(rèn)為有健康影響時（Directive on Guidelines for the Assessment of Novel Feeds:Microbial Sources,Draft-June 2007,The Canadian Food Inspection Agency)。因此，在使用微生物作為食品添加劑時，有兩種相互沖突的期望結(jié)果。第一種是在 整個加工和消化期間將微生物保持為活體狀態(tài)，而第二種完全相反的期望是完全或近乎完 全地將微生物滅活而不使活性肽失活。滅活的額外益處是其消除或降低德克薩斯側(cè)孢短芽 孢桿菌與腸中及環(huán)境中的微生物之間橫向基因轉(zhuǎn)移的機(jī)會;消除或限制與胃腸(GI)微生物 區(qū)系的潛在相互作用；消除或降低經(jīng)由活細(xì)胞灑落對人和環(huán)境的潛在風(fēng)險;和/或消除或降 低對源自消耗該飼料的動物的肉類的污染。因此，PTA-5854的連續(xù)孢子化嚴(yán)重限制將該菌 株用作DFM的能力，因為孢子對用于滅活營養(yǎng)細(xì)胞的大多數(shù)方法是極具抗性，要求用嚴(yán)苛且 昂貴的方法予以去除。
[0018] 因此，本領(lǐng)域中需要可作為滅活的DFM有效使用的德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌菌株。 [0019] 發(fā)明概述
[0020]在一個實施方案中，本發(fā)明是飼料或水添加劑，其包含孢子化缺陷型德克薩斯側(cè) 孢短芽孢桿菌細(xì)菌菌株的滅活的細(xì)胞或滅活的培養(yǎng)物。本發(fā)明還涉及可以添加到一種或多 種動物用的飼料或飲用水的本發(fā)明的滅活的經(jīng)干燥的細(xì)胞或培養(yǎng)物(例如凍干或噴霧干燥 的細(xì)胞或培養(yǎng)物）的用途，所述動物包括但不限于家禽、牲畜、牛、豬、雞、馬、火雞、綿羊、山 羊、鴨、鶴鶴、康沃爾游戲母雞(Cornish game hen)、鶴、農(nóng)場飼養(yǎng)的魚、蟹、奸、淡水龜、犬和 貓。例如，可以經(jīng)由巴氏消毒法、饑餓、溫度(熱、冷或冷凍）、脫水(例如加熱干燥、冷凍干燥、 噴霧干燥、曬干、風(fēng)干或真空干燥）、酸化、堿化、醇、去污劑、溶菌酶、機(jī)械力、季銨陽離子、氧 化劑(例如氯氧化物、過氧化氫、次氯酸鹽或臭氧)和/或輻射(例如UV、X射線或γ射線)來滅 活孢子化缺陷型德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌菌株培養(yǎng)物的細(xì)胞，然后可以將滅活的細(xì)胞或培 養(yǎng)物納入到飲用水或動物飼料中，如基于谷類的飼料，例如含有至少一種選自下組的谷類 的飼料:大麥、大豆、小麥、小黑麥（triticale)、黑麥(rye)、玉米及其組合。實際上，可以將 本發(fā)明添加到極其多種飼料中?？梢詫⒈景l(fā)明的滅活的細(xì)胞或分離肽與選自下組的家畜用 飲用水或飼料混合：代乳品（milk replacer)、生長飼料（grower feed)、肥育飼料 (finisher feed)、育維前飼料(pre-starter feed)、育維飼料(starter feed)、水及其組 合。
[0021] 本發(fā)明還包括用于促進(jìn)家畜和伴侶動物中的體重增加和飼料轉(zhuǎn)化的方法，其通過 將孢子化缺陷型德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物滅活(例如熱處理或脫水），并 以足以促進(jìn)生長的量向動物提供滅活的孢子化缺陷型德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌細(xì)胞或培 養(yǎng)基加細(xì)胞進(jìn)行。另可選擇的是，可以將有效量的孢子化缺陷型德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌 細(xì)胞或含有該細(xì)胞的培養(yǎng)基干燥(脫水)和/或通過造粒(一種熱處理方式)納入動物飼料中 或添加到飲用水中。
[0022] 飼料成分的例子還包括谷類、大豆粉、分離的大豆蛋白、分離的大豆油、分離的大 豆脂肪、脫脂乳、魚粉、肉粉、骨粉、血粉、血漿蛋白質(zhì)、乳清、稻糠、麥麩，并且還可以包含甜 味劑、礦物、維生素、鹽和草。
[0023] 在一個例示性的實施方案中，在含有飼料成分(如玉米粉和大豆粉)懸浮液的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)孢子化缺陷型德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌細(xì)胞。然后，可以對培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)胞滅活 和/或干燥/脫水以制備飼料添加劑(其中培養(yǎng)物中的微粒發(fā)揮BT肽的載體的功能）或增強(qiáng) 型飼料。
[0024] 本發(fā)明還包括用于預(yù)防和/或治療動物中微生物感染的方法，其通過以足以治療 和/或預(yù)防動物中微生物感染的有效量提供滅活的孢子化缺陷型德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌 細(xì)胞或培養(yǎng)物進(jìn)行。
[0025] 本發(fā)明還包括用于促進(jìn)正在生長的動物中重量增加和飼料轉(zhuǎn)化的方法，其通過以 足以治療和/或預(yù)防動物中微生物感染的有效量提供滅活的孢子化缺陷型德克薩斯側(cè)孢短 芽孢桿菌細(xì)胞或培養(yǎng)物進(jìn)行。
[0026] 本發(fā)明還包括孢子化缺陷型細(xì)胞作為人食物或水添加劑的用途。
[0027] 在一個例示性實施方案中，本發(fā)明提供了德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌的孢子化缺陷 型菌株，其具有小于約3.5x 1CT3、小于約lx 1CT4、小于約lx 1CT5、小于約lx 1CT6、小于約lx 10-7、小于約lx 10-8或小于約lx 10-9的存活率，存活率可以通過使培養(yǎng)物處于約50°C的溫 度約5分鐘并測定存活率或菌落形成能力來測量。
[0028] 在一個例示性實施方案中，當(dāng)對培養(yǎng)物進(jìn)行滅活處理時，孢子化缺陷型德克薩斯 側(cè)孢短芽孢桿菌菌株還展現(xiàn)出降低的存活，如小于約lx 10-9的存活率，所述滅活處理如饑 餓、冷凍（在缺乏有效量的冷凍保護(hù)劑的情況下）、脫水（于23°C用迅速真空（speed vaccum))、pH極端(例如pH 1 · 0或pH 13 · 0)、飽和丁醇、添加去污劑(例如1 % SDS)或裂解劑 (例如溶菌酶）、超聲處理、機(jī)械力（例如動物飼料造粒機(jī)的弗氏壓碎(French press))或過 氧化氫(例如大于或等于i%h2〇2)。
[0029] 本發(fā)明還涉及增加德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌制劑中的BT肽產(chǎn)量的方法，其通過使 用自孢子化缺陷型德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌菌株衍生的細(xì)胞進(jìn)行。本發(fā)明還涉及增加德克 薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌制劑中BT肽的穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)效用的方法，其通過在不純化或分離BT肽 的情況下使用自孢子化缺陷型德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌菌株衍生的細(xì)胞進(jìn)行。
[0030] 本發(fā)明還涉及德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌細(xì)胞的粉末狀形式，其中粉末基本上無孢 子。在一個例示性實施方案中，在液體培養(yǎng)基中將孢子化缺陷型德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌 的培養(yǎng)物培養(yǎng)至足夠的細(xì)胞密度，并將培養(yǎng)物脫水或干燥以生成基本無孢子的粉末。然后， 可以將該粉末與水或飼料成分混合以生成不含顯著量的來自德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌細(xì) 菌的活孢子的增強(qiáng)型動物飲料或食物。
[0031] 本發(fā)明還涉及將德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌細(xì)胞從用于德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌 生產(chǎn)的裝置和/或設(shè)施中除去或去污的方法，其如下進(jìn)行，處理該裝置和/或設(shè)施以滅活或 殺死孢子化缺陷型德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌菌株，然后可以簡單地將細(xì)胞沖洗掉。例如，可 以使用蒸汽或高溫水來清潔裝置和/或設(shè)施，其中水既會除去細(xì)胞又會殺死它們（由于溫度 所致），由此有效從裝置和/或設(shè)施除去德克薩斯側(cè)孢短芽孢桿菌細(xì)胞。