一種提高拜氏梭菌對4-羥基肉桂酸抗逆性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高拜氏梭菌對4-羥基肉桂酸抗逆 性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 石油枯竭，能源短缺等問題日益嚴重;丁醇具有與石油能源相似性質(zhì)，作為第二代 生物能源被廣泛認知;進而生物法生產(chǎn)丁醇逐漸成為研究熱點。傳統(tǒng)的丙酮-丁醇-乙醇發(fā) 酵(ABE發(fā)酵)底物原料一般直接采用葡萄糖、木糖等，消耗成本高，研究人員不得不將目標 鎖定向廉價的廢棄可再生的木質(zhì)纖維素原料(甘蔗渣、玉米芯、秸桿等）。然而木質(zhì)纖維素原 料在預(yù)處理成為微生物可利用的碳源的同時也釋放出大量的有機酸、糠醛、5-羥甲基糠醛、 酚類化合物等物質(zhì)，這些物質(zhì)嚴重抑制了菌體的生長及產(chǎn)醇，此外對于去除該抑制物的工 藝，成本消耗高，因此，在利用木質(zhì)纖維素為底物原料進行ABE發(fā)酵的基礎(chǔ)上，提高微生物自 身的毒素物質(zhì)抗逆性尤其重要。
[0003] 目前，生物丁醇的抗逆性研究主要集中在拜氏梭菌利用木質(zhì)纖維素水解液方面， 其中有毒物質(zhì)(如酚類化合物)的毒害作用尤為顯著。高濃度酚類物質(zhì)能夠改變細胞膜疏水 性，破壞細胞膜，導(dǎo)致菌體死亡。Thaddeus Ezeji等（Bioresource Technol. 2008，99: 5915-5922)利用BA101，以XAD-4樹脂脫毒的玉米芯稀硫酸水解和酶解液為發(fā)酵底物，得到 總?cè)軇┊a(chǎn)量為9.3 g/L;但BA101在未脫毒的稀酸水解液中幾乎不產(chǎn)丁醇。
[0004] 4-羥基肉桂酸，又稱為對香豆酸，英文名為p-coumaric acid，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
q〇Thaddeus Ezeji等（Biotechnol. Bioeng. 2007,97， 1460-1469.) 報道拜氏梭菌突變株BA101在2g/L4-羥基肉桂酸脅迫下完全不生長；同時，郭亭等(J Ind Microbiol Biotechnol·，2012，39(3)，401-407)研究發(fā)現(xiàn)，在P2發(fā)酵培養(yǎng)基中添加 0.5 g/L4_羥基肉桂酸時，拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)8052生長受到較大抑制，細胞 干重僅達到〇.5g/L左右，并且丁醇產(chǎn)量低于lg/L。然而，4-羥基肉桂酸對菌體的抑制具體機 制尚未明確，通過基因工程手段來提高產(chǎn)溶劑菌的抗逆性，提高丁醇得率越來越得到重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種提高拜氏梭菌對4-羥基肉桂酸抗逆性的方法。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種提高拜氏梭菌對4-羥基肉桂酸抗逆性的方法，該方法是將拜氏梭菌中依賴于NADH 的輔酶Q氧化還原酶亞基A失活。
[0007] 進一步的，使輔酶Q氧化還原酶亞基A失活的方法為使編碼輔酶Q氧化還原酶亞基A 的基因失活，使該基因在拜氏梭菌中不能正常表達，該基因的堿基序列如SEQ ID NO: 1所 不。
[0008] 進一步的，所述使編碼輔酶Q氧化還原酶亞基A基因失活的方法選自堿基突變失 活、堿基插入失活、堿基缺失失活。
[0009] 進一步的，通過堿基插入失活的方法使編碼輔酶Q氧化還原酶亞基A的基因失活。
[0010] 進一步的，通過插入二型內(nèi)含子使編碼輔酶Q氧化還原酶亞基A的基因失活。
[0011]進一步的，所述通過插入二型內(nèi)含子使編碼依賴于NADH的輔酶Q氧化還原酶亞基A 的基因失活，具體操作包括如下步驟： 1) 將SEQ ID N0:2所示的內(nèi)含子序列S-62連接到二型內(nèi)含子基因敲除質(zhì)粒中，得到重 組質(zhì)粒； 2) 將步驟1)得到的重組質(zhì)粒進行甲基化； 3) 將步驟2)得到的甲基化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化拜氏梭菌，篩選得到編碼依賴于NADH的輔酶 Q氧化還原酶亞基A基因失活的菌株。
[0012] 進一步的，SEQ ID N0:2所示的內(nèi)含子序列的基因插入位點為SEQ ID N0:1中第62 位和第63位堿基之間。
[0013] 按上述所述方法得到的拜氏梭菌。
[0014] 上述拜氏梭菌在發(fā)酵制備丁醇中的應(yīng)用。
[0015] 一種對4-羥基肉桂酸具有高抗逆性拜氏梭菌，在拜氏梭菌NCHMB 8052中缺失依賴 于NADH的輔酶Q氧化還原酶亞基A的正常功能，編碼輔酶Q氧化還原酶亞基A的堿基序列如 SEQ ID N0:1 所示。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是： (1)本發(fā)明將拜氏梭菌中編碼依賴于NADH的輔酶Q氧化還原酶亞基A基因 Cbei_2996進 行插入失活后，使得此基因不能正常表達，獲得Cbei_2996基因插入失活的重組菌株。
[0017] (2)本發(fā)明提供了一種簡單、高效的提高拜氏梭菌抗逆性的方法，借助此方法得 到的重組菌株對4-羥基肉桂酸具有較高抗逆性，當以葡萄糖為碳源，在100ml厭氧瓶中含有 4-羥基肉桂酸的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)時，丁醇產(chǎn)量達到3.4 g/L，而同等條件培養(yǎng)的出發(fā)菌株基 本不產(chǎn)醇。
[0018] (3)利用本發(fā)明方法構(gòu)建的重組菌株，其對4-羥基肉桂酸抗逆性強、丁醇產(chǎn)量高。
【附圖說明】
[0019] 圖1為質(zhì)粒pWJ的質(zhì)粒圖譜； 圖2為本發(fā)明使用二型內(nèi)含子插入失活的機理圖； 圖3為轉(zhuǎn)化子菌落PCR電泳圖； 圖4為本發(fā)明重組菌和出發(fā)菌株ΜΠΜΒ 8052對4-羥基肉桂酸的抗逆性考察。
【具體實施方式】
[0020] -種提高拜氏梭菌對4-羥基肉桂酸抗逆性的方法，該方法是將拜氏梭菌中依賴于 NADH的輔酶Q氧化還原酶亞基A失活。
[0021 ]優(yōu)選的，使輔酶Q氧化還原酶亞基A失活的方法為使編碼輔酶Q氧化還原酶亞基A的 基因失活，使該基因在拜氏梭菌中不能正常表達，該基因的堿基序列如SEQ ID N0:1所示。 [0022]優(yōu)選的，所述使編碼輔酶Q氧化還原酶亞基A基因失活的方法選自堿基突變失活、 堿基插入失活、堿基缺失失活。
[0023] 優(yōu)選的，通過堿基插入失活的方法使編碼輔酶Q氧化還原酶亞基A的基因失活。
[0024] 優(yōu)選的，通過插入二型內(nèi)含子使編碼輔酶Q氧化還原酶亞基A的基因失活，又稱為 二型內(nèi)含子基因敲除技術(shù)。
[0025] 優(yōu)選的，所述通過插入二型內(nèi)含子使編碼依賴于NADH的輔酶Q氧化還原酶亞基A的 基因失活，具體操作包括如下步驟： 1) 將SEQ ID N0:2所示的內(nèi)含子序列S-62連接到二型內(nèi)含子基因敲除質(zhì)粒中，得到重 組質(zhì)粒； 2) 將步驟1)得到的重組質(zhì)粒進行甲基化； 3) 將步驟2)得到的甲基化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化拜氏梭菌，篩選得到編碼依賴于NADH的輔酶 Q氧化還原酶亞基A基因失活的菌株。
[0026]優(yōu)選的，SEQ ID N0:2所示的內(nèi)含子序列的基因插入位點為SEQ ID N0:1中第62位 和第63位堿基之間。
[0027]優(yōu)選的，所述二型內(nèi)含子基因敲除質(zhì)粒為pWJ質(zhì)粒，該質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0028]優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒甲基化操作為將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli Top 10 中進行甲基化。
[0029]優(yōu)選的，所述拜氏梭菌為拜氏梭菌NCBffi 8052。
[0030] 按上述所述的提高拜氏梭菌對4-羥基肉桂酸抗逆性的方法得到的拜氏梭菌。
[0031] 上述所述拜氏梭菌在發(fā)酵制備丁醇中的應(yīng)用。
[0032]優(yōu)選的，所述發(fā)酵環(huán)境中存在4-羥基肉桂酸。
[0033] 一種對4-羥基肉桂酸具有高抗逆性拜氏梭菌，在拜氏梭菌NCHMB 8052中缺失依賴 于NADH的輔酶Q氧化還原酶亞基A的正常功能，編碼輔酶Q氧化還原酶亞基A的堿基序列如 SEQ ID N0:1 所示。
[0034] 根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本 發(fā)明。
[0035] 實施例1 :拜氏梭菌Cbei_2996基因失活突變株的構(gòu)建方法 (1)設(shè)計內(nèi)含子： 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的拜氏梭菌的Cbei_2996基因序列（如SEQ ID N〇:l所示），即編碼 輔酶Q氧化還原酶亞基A的堿基序列（nuoA)，借助軟件設(shè)計合適的插入基因位點（http:// www. clostron. com)，通過前期的實驗篩選和驗證，選擇插入在Cbei_2996基因序列第62和 63個堿基之間，并生成內(nèi)含子序列，合成的內(nèi)含子為S-62,其序列如SEQ ID N0:2所示。
[0036] (2)Cbei_2996插入失活載體的構(gòu)建： 用Xhol和BsrGI分別雙酶切載體pWJ(上海生科院楊晟老師提供，其序列如SEQ ID N0:5 所示，pWJ的質(zhì)粒圖譜如圖1所示)和DNA片段S-62。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒(Takara)純化后， 通過T4連接酶(Takara)過夜連接。將連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli DH5a(本實驗 室），涂布到含有50ug/ml氨芐霉素抗性LB平板，37°C培養(yǎng)12-16h，挑取轉(zhuǎn)化子，接到液體 含有50ug/ml氨芐霉素 LB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)12h，提取重組質(zhì)粒(AXYGEN質(zhì)粒提取 試劑盒），測序驗證，獲得Cbei_2996基因的二型內(nèi)含子基因敲除載體pWJ-62。
[0037] (3)載體 pWJ-62 甲基化： 制備含有PAN2質(zhì)粒的E.coli Top 10(本實驗室）的化學(xué)感受態(tài)，將測序成功的Cbei_ 2996插入失活載體pWJ-62轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli Top 10,由于pAN2質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性， 故涂布到含有SOμg/ml氨芐霉素和lOμg/ml四環(huán)素雙抗性LB平板，37°C培養(yǎng)12-16h，挑取轉(zhuǎn) 化子，接到液體含有50ug/ml氨芐霉素和10ug/ml四環(huán)素 LB培養(yǎng)基中，37°C、200r培養(yǎng)12h， 提取甲基化