一株耐高溫園林廢棄物分解菌st5及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從園林廢棄物堆肥中篩選出的一株高效降解纖維素的耐熱菌及其在園林廢棄物高溫堆肥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]園林廢棄物指園林植物自然凋落或人工修剪所產(chǎn)生的枯枝、落葉、草肩、殘花、樹(shù)木與灌木剪枝及其它植物殘?bào)w等，主要成分為難降解的纖維素和半纖維素。近年來(lái)，我國(guó)園林廢棄物每年8%_10%的速度遞增，給城市綠色化進(jìn)程帶來(lái)了巨大阻力，目前我國(guó)處理園林廢棄物的方式主要為焚燒和填滿，這兩種處理方式不僅浪費(fèi)了可再生資源還造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此，如何合理有效處理園林廢棄物，使其資源化利用是目前大家普遍關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。
[0003]利用堆肥技術(shù)將園林廢棄物腐熟制成有機(jī)肥料和育苗基質(zhì)等，是其資源化利用的有效出路之一，然而園林廢棄物中含有大量的木質(zhì)素、纖維素等難降解的物質(zhì)，導(dǎo)致堆肥效率低、周期長(zhǎng)，大大限制了園林廢棄物的再利用價(jià)值。因此需要向堆肥中加入特定的微生物，以加快園林廢棄物腐熟過(guò)程。纖維素降解菌是一類能夠產(chǎn)生胞外纖維素酶將纖維素大分子水解成葡萄糖的微生物，可以加速纖維素材料的降解速度。自然界中，產(chǎn)生纖維素的微生物種類很多，目前研究和應(yīng)用得較多的是真菌，如木霉、青霉屬、曲霉屬、根霉屬等。細(xì)菌和放線菌的研究和應(yīng)用均較少。堆肥過(guò)程中纖維素降解主要發(fā)生在高溫期，而真菌主要在中溫條件下，酶活最大，隨著堆肥過(guò)程溫度的上升，真菌活菌數(shù)量及其產(chǎn)生的酶活性大大降低，這就限制了產(chǎn)纖維素酶霉菌的在堆肥中的利用。耐高溫纖維素降解菌的篩選和應(yīng)用是解決上述問(wèn)題的有效措施。
[0004]很多纖維素降解菌都是針對(duì)玉米秸桿、稻草、麥秸等農(nóng)業(yè)廢棄物，很少有專門針對(duì)園林廢棄物纖維素材料的降解菌的篩選和利用研究。中國(guó)專利“一株高溫纖維素降解菌及其應(yīng)用”(專利申請(qǐng)?zhí)?201410018582.6)公布了一株從園林廢棄物高溫期堆肥樣品中分離的高溫纖維素降解菌地芽孢桿菌，纖維素酶活性為7.8 U/ml，該菌為細(xì)菌。關(guān)于從園林廢棄物堆肥中分離耐高溫纖維素降解放線菌的報(bào)道較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供一株耐高溫?zé)崞胀ㄦ溍咕?，該菌能?0_70°C高溫內(nèi)大量產(chǎn)酶，纖維素酶活性高，具有耐高溫、高效降解纖維素特性，可將其作為微生物菌劑應(yīng)用于高溫堆肥體系中，適用于園林廢棄物堆肥。
[0006]本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:一株耐高溫纖維素降解菌熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris) ST5，保藏編號(hào)為CGMCC N0.12137，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
[0007]本發(fā)明所述熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris) ST5已于2016年2月18日為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵政編碼:100101)，其保藏號(hào)為CGMCC N0.12137，經(jīng)檢測(cè)存活。
[0008]本發(fā)明熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris) ST5，是從北京昌平區(qū)某蘋果園園林廢棄物堆肥高溫中期采集的樣品中分離的菌種，將其編號(hào)為菌株ST5，該菌能夠在40-70°C條件下產(chǎn)生纖維素酶并降解纖維素。菌株在高氏I號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，氣生菌絲灰色，基內(nèi)菌絲深褐色，不產(chǎn)生可溶性色素。顯微鏡下，菌體呈菌絲狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，孢子卵圓形，表面光滑，孢子絲螺旋狀，柔曲。結(jié)合菌落菌體形態(tài)特征和基于細(xì)菌16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris)。
[0009]本發(fā)明所述菌株生產(chǎn)纖維素酶的方法，將該菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分:CMC-Na 0.5%，蛋白胨 1%，麩皮 3%, NaCl 2%, KH2PO4 0.l%g,MgS04.7H20 0.02%, (NH4)2SO40.3%，pH 7.0-7.6)中，于溫度50°C、rpml50轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)3_4d，離心取上清液，測(cè)定纖維素酶活性。
[0010]本發(fā)明還提供一種適用于園林廢棄物為主要堆肥材料的高溫堆肥腐熟劑，該腐熟劑以液體發(fā)酵方式獲得，菌液濃度為5 X 19 CFU/mL，麩皮和玉米面2:1混合作為菌液吸附劑，按菌液與吸附劑1:1混合，制作成固態(tài)菌劑。
[0011 ] 同時(shí)，本發(fā)明還提供所述熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris) ST5菌株在以園林廢棄物為主要材料的堆肥腐熟中的應(yīng)用，以園林廢棄物為主要堆肥原料，添加動(dòng)物糞便和水，使混合物料碳氮比為25-40:1、含水率50-60%，固態(tài)腐熟劑按物料重量的5%比例接種到堆肥物料中，進(jìn)行高溫堆肥。
[0012]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明所述熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris) ST5是從園林廢棄物堆肥中篩選出降解纖維素的菌種，可在40-70°C溫度范圍內(nèi)產(chǎn)生較多的纖維素酶，酶活高達(dá)28.02 U/mL，具有耐高溫、高效降解纖維素特性。相對(duì)真菌在中溫條件下酶活最大，而細(xì)菌產(chǎn)酶活力較低的問(wèn)題，熱普通鏈霉菌既能適應(yīng)高溫環(huán)境，又能產(chǎn)生較高的纖維素酶，對(duì)纖維素材料具有很好的降解能力，所以熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris)更能適應(yīng)堆肥過(guò)程復(fù)雜環(huán)境。
[0013]將本發(fā)明獲得的耐高溫纖維素降解菌制成固態(tài)腐熟劑添加到以園林廢棄物為主要材料的堆肥中，與不接種的對(duì)照相比，能夠提高堆肥進(jìn)入高溫期的時(shí)間、延長(zhǎng)高溫期持續(xù)時(shí)間已經(jīng)高溫期溫度，降低堆肥C/N比，從而加快堆肥腐熟進(jìn)程?？蓪⑵渥鳛槲⑸锞鷦?yīng)用于高溫堆肥體系中，適用于園林廢棄物堆肥。
[0014]本發(fā)明是針對(duì)園林廢棄物堆肥材料篩選的菌種和制備的腐熟劑，可以為園林廢棄物的資源化利用提供一條合理、有效的途徑，實(shí)現(xiàn)降低環(huán)境污染、資源循環(huán)利用的目的。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris)分離純化圖片
圖2本發(fā)明熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris)的16S rDNA基因序列。
[0016]圖3通過(guò)熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris)和相近菌株16SrDNA的基因序列進(jìn)行同源性Blast比對(duì)時(shí)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖片。
[0017]圖4堆肥過(guò)程中堆體溫度變化。
[0018]圖5堆肥過(guò)程中碳氮比(C/N比)變化。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】的詳細(xì)描述來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的限制，僅僅作示例說(shuō)明。
[0020]實(shí)施例1耐高溫纖維素降解菌株篩選
從北京昌平區(qū)某蘋果園園林廢棄物堆肥高溫初期、高溫中期、高溫后期材料、北京延慶平原造林地區(qū)園林綠化廢棄物堆積物中采集樣品；稱取上述新鮮樣品1g放于裝有10粒玻璃珠、并盛有90 ml無(wú)菌水的錐形瓶中，置于30°C 150 rpm的搖床中搖30 min，使樣品充分散開(kāi)，50°C下靜置富集培養(yǎng)24h。用無(wú)菌吸管吸取I ml上清液加入到含有9ml無(wú)菌水的試管中，此即為10—1樣品稀釋液，再?gòu)?0—1樣品中取Iml加入到9ml無(wú)菌水中，此即為10—2樣品稀釋液，以此類推，得到10—3、10—4、10—5、10—6樣品稀釋液，然后用移液器吸取100 μ?的10—3、10—4、10—5、10—6樣品稀釋液于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基組成為:K2HPO4 0.5g，微晶纖維素1.88g，MgS04 0.25g，明膠2.0g，剛果紅0.5g，瓊脂16g，蒸饋水1000ml，pH
7.0)，用涂布器把稀釋液均勻涂布于整個(gè)平板，并置于50°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。挑選在纖維素剛果紅平板上有明顯透明圈的菌落，進(jìn)行編號(hào)，再進(jìn)行反復(fù)劃線分離純化獲得純種菌株，將分離后的菌種接到斜面上，4°C保存進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0021]將保藏于4°C的純菌株轉(zhuǎn)接到羧甲基纖維素培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分=CMC-Na 15.0g，NH4NO3 l.0g，酵母膏 1.0g，MgS04.7H20 0.5g, KH2PO4 l.0g，蒸餾水 1000ml，瓊脂 16g，pH
7.0)平板上，50°C下活化培養(yǎng)，然后挑起平板上的單菌落轉(zhuǎn)接到纖維素剛果紅平板上，置于50 0C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72h后