分離淋巴細(xì)胞的分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于分離淋巴細(xì)胞的分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在標(biāo)準(zhǔn)的分離過程中，細(xì)胞必須與分離液接觸15-45分鐘的時(shí)間，以達(dá)到最佳分離效果。在這段時(shí)間內(nèi)，分離液中各組分可能通過被動(dòng)擴(kuò)散、細(xì)胞的主動(dòng)運(yùn)輸、胞吞/胞飲作用、表面黏附等途徑，在細(xì)胞內(nèi)部蓄積，且此部分蓄積成分，很難通過常規(guī)的洗滌從分離得至IJ的目標(biāo)細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞)中完全去除。
[0003]而且目前的梯度離心分離方法步驟繁瑣，技巧性較強(qiáng)，對(duì)操作者的經(jīng)驗(yàn)要求比較高:梯度離心分離需要三步，尤其是第二步，要在高密度的分離液上小心翼翼的鋪上低密度的細(xì)胞懸液而不能弄混界面，這極大的考驗(yàn)操作者的經(jīng)驗(yàn)和耐心，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，容易疲勞，而一旦弄混液面，分離效果將大受影響，甚至分離不出淋巴細(xì)胞層。而且目前的分離液多有一定的毒性，影響分離效果和分離后的細(xì)胞質(zhì)量，導(dǎo)致分離效率較低。
[0004]因此，有必要提供一種能夠提高分離效率、保證分離細(xì)胞的純度和活性的分離方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠提高分離效率、保證分離細(xì)胞的純度和活性的分離淋巴細(xì)胞的分離方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供技術(shù)方案如下:
[0007]—方面，提供一種分離淋巴細(xì)胞的分離方法，包括如下步驟:
[0008]步驟1:將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐3?5重量份，海藻糖2?4重量份，超低粘度海藻酸鈉0.3?0.8重量份，泛影葡胺I?3重量份，聚二烯丙基二甲基氯化銨0.1?0.15重量份充分溶解于滅菌水配制成100重量份的生理溶液，再經(jīng)過濾膜過濾除菌得到分離液；
[0009]步驟2:將所述分離液加入離心管中，所述分離液的體積不大于離心管體積的1/2;
[0010]步驟3:將抗凝劑處理過的樣品經(jīng)平衡鹽溶液或無血清培養(yǎng)基稀釋后鋪在所述分離液上，在8_25°C，200g-800g，10?30111；[11條件下離心。
[0011]所述樣品的來源為外周血、臍帶血或骨髓。
[0012]本發(fā)明使用右旋糖酐、海藻糖、超低粘度海藻酸鈉和聚二烯丙基二甲基氯化銨配制的分離液時(shí)，操作者可以直接將細(xì)胞懸浮液鋪設(shè)在分離液上，鋪設(shè)過程無須過多考慮液面的破壞，對(duì)操作者的操作經(jīng)驗(yàn)要求較低;本發(fā)明配方中的全部原料均符合靜注級(jí)原料藥標(biāo)準(zhǔn)，原料不確定性小，安全性高并具有較好的殺腫瘤活性;本發(fā)明的組合物可配成生理溶液狀態(tài)的分離介質(zhì)，對(duì)血液樣品進(jìn)行離心處理后，淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞將在分離介質(zhì)和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細(xì)胞條帶，而紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等其他細(xì)胞在離心力及本發(fā)明組合物的作用下分布在離心管底和分離介質(zhì)層;本發(fā)明采用的右旋糖酐(Dextran)是一種分支化的葡聚糖，其通過一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和變形鏈球菌。臨床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血漿代用品;海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個(gè)葡萄糖分子以I，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用，對(duì)單個(gè)核細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用;超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于紅細(xì)胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化銨為強(qiáng)陽離子聚電解質(zhì)有助于紅細(xì)胞的沉淀;本發(fā)明的分離液中的各組分配比合理從而起到良好的分離效果。
[0013]進(jìn)一步地，所述步驟I為:將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐3.5?4.5重量份，海藻糖2.5?3.5重量份，超低粘度海藻酸鈉0.4?0.8重量份，泛影葡胺1.5?2.5重量份，聚二稀丙基二甲基氯化銨0.12?0.15重量份充分溶解于滅菌水配制成100重量份的生理溶液，再經(jīng)過超濾膜過濾除菌得到分離液。
[0014]優(yōu)選地，所述步驟I為:將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐4重量份，海藻糖3重量份，超低粘度海藻酸鈉0.7重量份，泛影葡胺2重量份，聚二烯丙基二甲基氯化銨0.13重量份充分溶解于滅菌水配制成100重量份的生理溶液，再經(jīng)過超濾膜過濾除菌得到分離液。
[0015]進(jìn)一步地，所述分離液的密度為1.070?1.09(^/0113，滲透壓為275?300811101/1^，pH為6?9，粘度為3.0?5.0cp。
[0016]優(yōu)選地，所述步驟I中的滅菌水為滅菌注射用水。
[00?7] 進(jìn)一步地，其特征在于，所述右旋糖酐為Dextran7 O。
[0018]優(yōu)選地，所述步驟I中的濾膜為滅菌的0.22μπι濾膜。
[0019]進(jìn)一步地，所述步驟2的稀釋比例為1:2-2:1。
[0020]優(yōu)選地，所述步驟2的稀釋比例為1:1-1.5:1。
[0021]綜上所述，本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)為:
[0022]本發(fā)明使用右旋糖酐、海藻糖、超低粘度海藻酸鈉和聚二烯丙基二甲基氯化銨配制的分離液時(shí)，操作者可以直接將細(xì)胞懸浮液鋪設(shè)在分離液上，鋪設(shè)過程無須過多考慮液面的破壞，對(duì)操作者的操作經(jīng)驗(yàn)要求較低;本發(fā)明配方中的全部原料均符合靜注級(jí)原料藥標(biāo)準(zhǔn)，原料不確定性小，安全性高并具有較好的殺腫瘤活性;本發(fā)明的組合物可配成生理溶液狀態(tài)的分離介質(zhì)，對(duì)血液樣品進(jìn)行離心處理后，淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞將在分離介質(zhì)和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細(xì)胞條帶，而紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等其他細(xì)胞在離心力及本發(fā)明組合物的作用下分布在離心管底和分離介質(zhì)層;本發(fā)明采用的右旋糖酐(Dextran)是一種分支化的葡聚糖，其通過一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和變形鏈球菌。臨床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血漿代用品;海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個(gè)葡萄糖分子以I，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用，對(duì)單個(gè)核細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用;超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于紅細(xì)胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化銨為強(qiáng)陽離子聚電解質(zhì)有助于紅細(xì)胞的沉淀。
【具體實(shí)施方式】
[0023]為使本發(fā)明的實(shí)施例要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。但本發(fā)明絕非限于這些例子。以下所述僅為本發(fā)明較好的實(shí)施例，僅僅用以解釋本發(fā)明，并不能因此而理解為本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
[0024]實(shí)施例一
[0025]在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境下，在20°C下，將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐3g，海藻糖4g，超低粘度海藻酸鈉0.Sg，泛影葡胺Ig，聚二烯丙基二甲基氯化銨0.15g充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100mL，再經(jīng)過0.22μπι濾膜過濾至一支無菌、無內(nèi)毒素的容器內(nèi)。
[0026]實(shí)施例二
[0027]在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境下，在20°C下，將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐5g，海藻糖2g，超低粘度海藻酸鈉0.3g，泛影葡胺3g，聚二烯丙基二甲基氯化銨0.1g充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100mL，再經(jīng)過0.22μπι濾膜過濾至一支無菌、無內(nèi)毒素的容器內(nèi)。
[0028]實(shí)施例三
[0029]在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境下，在20°C下，將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐
3.5g，海藻糖3.5g，超低粘度海藻酸鈉0.4g，泛影葡胺2.5g，聚二烯丙基二甲基氯化銨0.15g充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100mL，再經(jīng)過0.22μπι濾膜過濾至一支無菌、無內(nèi)毒素的容器內(nèi)。
[0030]實(shí)施例四
[0031]在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境下，在20°C下，將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐
4.5g，海藻糖2.5g，超低粘度海藻酸鈉0.Sg，泛影葡胺1.5g，聚二烯丙基二甲基氯化銨0.12g充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100mL，再經(jīng)過0.22μπι濾膜過濾至一支無菌、無內(nèi)毒素的容器內(nèi)。
[0032]實(shí)施例五
[0033]在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境下，在20°C下，將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐
3.6g，海藻糖3.3g，超低粘度海藻酸鈉0.5g，泛影葡胺2.2g，聚二烯丙基二甲基氯化銨0.14g充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100mL，再經(jīng)過0.22μπι濾膜過濾至一支無菌、無內(nèi)毒素的容器內(nèi)。
[0034]實(shí)施例六
[0035]在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境下，在20°C下，將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐
4.2g，海藻糖2.Sg，超低粘度海藻酸鈉0.7g，泛影葡胺1.Sg，聚二烯丙基二甲基氯化銨0.12g充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100mL，再經(jīng)過0.22μπι濾膜過濾至一支無菌、無內(nèi)毒素的容器內(nèi)。
[0036]實(shí)施例七
[0037]在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境下，在20°C下，將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐
4.5g，海藻糖3.4g，超