一種攜帶抗腫瘤蛋白靶向性exosome的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種攜帶抗腫瘤蛋白革E1向性exosome 的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 藥物傳輸系統(tǒng)(drug delivery system)是指為提高療效，在防治疾病的過程中， 人們采用多種治療藥物的不同的給予藥物的方法，目前藥物傳輸系統(tǒng)分為以下幾種:緩釋、 控釋給藥系統(tǒng);靶向給藥系統(tǒng);脈沖式給藥系統(tǒng);經(jīng)皮給藥系統(tǒng)等。
[0003] 外泌體（exosome)是直徑約為30-lOOnm、密度為1.13-1.21g/ml的囊泡，是由細(xì)胞 分泌的納米級(jí)顆粒。外泌體廣泛天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳及體外細(xì) 胞培養(yǎng)液。外泌體最早由Trams等于1981年在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中被發(fā)現(xiàn)。外 泌體屬于生物體內(nèi)囊泡的一種，早期的研究認(rèn)為，外泌體執(zhí)行蛋白運(yùn)輸功能，特異靶定受體 細(xì)胞，交換蛋白和脂類或引發(fā)下游信號(hào)事件。直到2007年，研究人員發(fā)現(xiàn)外泌體也運(yùn)輸核 酸，參與細(xì)胞間通訊。2013年美國、德國3位科學(xué)家James、Randy W和Thomas C因發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi) 的主要運(yùn)輸系統(tǒng)一一囊泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)機(jī)制，榮獲2013年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。外泌體由 于攜帶多種蛋白質(zhì)、miRNA、ncRNA，作為細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸?shù)妮d體發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。例如， 腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體能夠介導(dǎo)血管再生腫瘤細(xì)胞增殖及免疫逃逸，而樹突狀細(xì)胞源性外 泌體則能夠引起機(jī)體有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。目前研究發(fā)現(xiàn)，外泌體內(nèi)含有與細(xì)胞來源相 關(guān)的蛋白質(zhì)、RNA等，成為細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸?shù)奶烊惠d體，2011年Matthew等人通過構(gòu)建攜帶沉默 siRNA-BACEl的人工外泌體，將藥物突破血腦屏障靶向送入大腦細(xì)胞，可見外泌體有望成為 一種新型天然的理想藥物運(yùn)輸載體。
[0004] 我們前期研究發(fā)現(xiàn)了一種天然的抗腫瘤蛋白，該蛋白由人的LINC-PINT基因（基因 登錄號(hào)NR_015431)編碼，該蛋白是由87個(gè)氨基酸組成的分子量為9.6KD的小蛋白，命名 PINT_87aa;細(xì)胞功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)該蛋白可以進(jìn)入外泌體(exosome)被細(xì)胞分泌出去，發(fā)揮 抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。Lamp2b基因?qū)儆谕饷隗w膜上的一種蛋白，由研究者將目標(biāo)蛋白 與此蛋白融合表達(dá)，可以將目標(biāo)蛋白裝載到外泌體中。腫瘤穿透肽iRGD(CRGDK/RGHVEC)是 由9個(gè)氨基酸組成的腫瘤革E1向性多肽，2010年Kazuki Sugahara等用這種可穿透實(shí)體腫瘤的 iRGD多肽以化學(xué)方式和抗腫瘤藥物發(fā)生結(jié)合使得藥物進(jìn)入到體內(nèi)生長的腫瘤的血管外組 織之中，發(fā)揮強(qiáng)效的抗腫瘤藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)以上要解決的技術(shù)問題，提供一種能夠有效抑制腫瘤生長的 仿生物源性抗腫瘤蛋白輸送載體。
[0006] 為此，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案。
[0007] -種攜帶抗腫瘤蛋白革巴向性exosome的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
[0008] (1)構(gòu)建表達(dá)腫瘤靶向性多肽iRGD、exosome膜蛋白lamp2b及抗腫瘤蛋白PINT- 87aa的融合基因表達(dá)質(zhì)粒；
[0009] (2)將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人的胚腎細(xì)胞HEK293細(xì)胞中，puro抗生素篩選獲得穩(wěn)定表 達(dá)抗腫瘤融合蛋白的細(xì)胞系；
[0010] (3)細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞釋放出來的攜帶抗腫瘤蛋白的exosome進(jìn)行分離純化。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述表達(dá)質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中，將編碼LAMP2蛋白的核苷酸序列，去掉終止密碼子后添加 T2A多肽連接子與PINT-87aa蛋白連接，lamp2b的另一端連接編碼iRGD的核苷酸序列，獲得 此片段后通過NheI、BamHI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶將所述片段連接到pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP+ Puro質(zhì)粒中。
[0013] 優(yōu)選地，所述步驟(2)中，將HEK293細(xì)胞50萬個(gè)細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)板中，24h細(xì) 胞貼壁后可進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染前，將100微升無血清培養(yǎng)基DMEM和5微升表達(dá)質(zhì)粒制成質(zhì)粒 MIX1混合液;將100微升無血清培養(yǎng)基DMEM+6微升liop2000脂質(zhì)體均勻混合，制成脂質(zhì)體 MIX2混合液;將ΜΙΧ?；旌弦汉蚆IX2混合液等比例混合，室溫放置20min;按照轉(zhuǎn)染試劑操作 說明書操作;最終6孔板中的孔終體積為1毫升，轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，換成1毫升普通培養(yǎng)基，細(xì)胞 培養(yǎng)條件為37°C、5% (體積濃度)二氧化碳;細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，換用終濃度為2mg/L的puro 嘌呤霉素進(jìn)行篩選，隔日換液，篩選5天后，建立穩(wěn)定表達(dá)抗腫瘤蛋白PINT-87aa的HEK293細(xì) 胞系。
[0014] 優(yōu)選地，所述正常培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清和1 %青霉素-鏈霉素，以 上百分比為體積百分比。
[0015] 優(yōu)選地，所述步驟（3)中，采用差異離心的方法從HEK293培養(yǎng)細(xì)胞液中分離純化 exosome〇
[0016] 優(yōu)選地，所述步驟(3)包括：當(dāng)HEK293細(xì)胞培養(yǎng)到80 %融合度的時(shí)候，撤去培養(yǎng)基， PBS洗滌細(xì)胞3遍，換成無血清無雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí);之后收取細(xì) 胞培養(yǎng)上清，按照如下操作分離純化培養(yǎng)上清中的exosome:所述細(xì)胞培養(yǎng)上清置于50ml離 心管中，4°C、1000 X g離心5min，去除較大的細(xì)胞碎片，取第一上清;然后將所述第一上清于 4°C、16500 X g離心30min，取第二上清;然后將所述第二上清于4°C、100000 X g離心2h，棄上 清，取第一沉淀;將所述第一沉淀用lml PBS吹打洗滌，然后4 °C、100000 X g離心2h，棄上清， 取第二沉淀；然后再用roS洗滌所述第二沉淀，于4°C、100000 X g離心2h，最后得到第三沉 淀，即為分離純化后的exosome。
[0017] 本發(fā)明還提供了所述方法制備獲得的exosome在制備用于抑制腫瘤生長的藥物中 的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明將抗腫瘤蛋白PINT-87aa與腫瘤靶向性多肽iRGD及exosome的膜蛋白 lamp2b融合，構(gòu)建基因融合表達(dá)質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到供體細(xì)胞HEK293中，嘌呤霉素 puro篩選 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞株。我們將構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)抗腫瘤蛋白融合基因的供體細(xì)胞 擴(kuò)增培養(yǎng)，提取細(xì)胞分泌的exosome，并采用惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251對(duì)exosome的功能效果 進(jìn)行測(cè)試。細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明人工制備的exosome能夠有效的抑制腫瘤細(xì)胞 U251的生長。由此可見，本發(fā)明成功構(gòu)建了一種仿生物源性抗腫瘤蛋白輸送載體，能夠高效 抑制腫瘤的生長，為惡性的治療提供了一種潛在的理想的治療方法。
【附圖說明】
[0019]圖1是抗腫瘤蛋白PINT-87aa與腫瘤祀向性多肽iRGD及exosome的膜蛋白lamp2b融 合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。
[0020]圖2是供體細(xì)胞HEK293穩(wěn)定表達(dá)抗腫瘤蛋白PINT-87aa的熒光圖片。
[0021] 圖3是蛋白檢測(cè)exosome中PINT_87aa的表達(dá)情況。
[0022]圖4是MTT檢測(cè)抗腫瘤exosome抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步的詳述，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。除 非另外指出，本發(fā)明及以下實(shí)施例中所涉及的術(shù)語、英文縮寫均為本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解。
[0024] 一 ：腫瘤革巴向性多肽iRGD、exosome膜蛋白lamp2b及抗腫瘤蛋白PINT_87aa的融合 基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
[0025] 根據(jù)文獻(xiàn)Ruoslahti E等報(bào)道使用的的腫瘤靶向性多肽iRGD(氨基酸序列： CRGDKGPDC)，設(shè)計(jì)了編碼該多肽的核苷酸序列;根據(jù)NCBI基因庫中提交的LAMP2(基因號(hào)NM_ 013995)全長RNA序列，找出編碼蛋白的序列，去掉終止密碼子后添加 T2A多肽連接子與 PINT-87aa蛋白連接，lamp2b的另一端連接編碼iRGD的核苷酸序列，該框架核苷酸全序列長 度為1575bp，其構(gòu)建示意圖如圖1所示，具體的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。將1575bp序 列采用全基因化學(xué)合成的方法獲得完整片段(全基因合成委托商業(yè)化公司上海捷瑞生物）； 獲得此片段后通過Nhel和BamHI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶將片段連接到pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP+ Pur〇 (SBI公司貨號(hào)CD513B-1)質(zhì)粒中；同時(shí)構(gòu)建對(duì)照質(zhì)粒（即不攜帶PINT-87aa抗腫瘤蛋 白）。抗腫瘤蛋白PINT-87aa與腫瘤革巴向性多肽iRGD及exosome的膜蛋白lamp2b融合表達(dá)質(zhì) 粒構(gòu)建示意圖如圖1所示。
[0026] 所述抗腫瘤蛋白PINT_87aa與腫瘤革巴向性多肽iRGD及exosome的膜蛋白lamp2b融 合表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建1575bp基因全長序列，如SEQ ID N0:1所示。
[0027] PINT_87aa氨基酸序列87個(gè)氨基酸全長序列如SEQ ID NO:2所示。
[0028] 二：腫瘤革巴向性多肽iRGD、exosome膜蛋白lamp2b及抗腫瘤蛋白PINT-87aa的融合 基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞
[0029]將步驟一中構(gòu)建的融合基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，并用puro抗生素篩選穩(wěn)定 表達(dá)細(xì)胞系，【具體實(shí)施方式】如