細菌超氧化物歧化酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種細菌超氧化物歧化酶及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是生物體防御氧化損傷的一種十分重要的金屬酶，它可以催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)產(chǎn)生分子氧和過氧化氫。超氧陰離子與人類及動植物的許多疾病的發(fā)生和形成有關(guān)。因此，SOD作為一種專一性的氧自由基清除劑，可以防御超氧陰離子的毒性，維持細胞正常的生理代謝，對機體具有保護作用。超氧化物歧化酶在醫(yī)藥、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)方面有著廣闊的應(yīng)用前景，因此受到國內(nèi)外普遍重視。
[0003]SOD廣泛存在于動物、植物、所有好氧微生物及少數(shù)厭氧微生物體內(nèi)。目前SOD主要從動物組織中提取，比如牛肝和紅細胞等，產(chǎn)量受到很大限制，且容易受到原料來源、安全性及質(zhì)量不穩(wěn)定等因素的影響;微生物來源廣，繁殖快，時間短，易培養(yǎng)，用來制備SOD具有很大潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種細菌超氧化物歧化酶的制備方法。
[0005]實現(xiàn)上述目的的具體技術(shù)方案如下。
[0006]—種細菌超氧化物歧化酶的制備方法，該細菌超氧化物歧化酶包括酶液和酶粉兩種形式，由保藏編號為CCTCC M 2015633的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)發(fā)酵培養(yǎng)制備得到，包括以下步驟:
[0007](I)格氏乳球菌的活化:將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)在瓊脂-M17培養(yǎng)基上活化；
[0008](2)格氏乳球菌種子液的制備:將活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液；
[0009](3)格氏乳球菌的發(fā)酵培養(yǎng):將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)后，離心收集發(fā)酵濕菌體直接用于下一步超氧化物歧化酶的制備，或者將離心收集的發(fā)酵濕菌體凍干得到凍干菌粉；
[0010](4)超氧化物歧化酶的制備:將步驟(3)收集的發(fā)酵濕菌體或者凍干菌粉，懸浮于pH為7.2-8.5的磷酸緩沖液中，加入溶菌酶裂解2?24h，離心，將上清液調(diào)節(jié)pH為4.0?5.6，冰冷放置l_3h，離心除沉淀，即得細菌超氧化物歧化酶酶液;或?qū)⒚敢簝龈杉吹眉毦趸锲缁该阜邸?br>[0011 ]在其中一些實施例中，步驟(3)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:0.1?1wt %的碳源，
0.1?1wt%的氮源，O?5wt%氮源以外的無機鹽，余量為蒸饋水。
[0012]在其中一些實施例中，所述碳源選自單糖、雙糖、多糖、酵母浸膏、蛋白胨、牛肉膏；所述氮源選自酵母浸膏、蛋白胨、無機銨鹽、無機硝酸鹽、尿素、玉米漿、豆餅粉;所述氮源以外的無機鹽選自磷酸鹽、鈉鹽、鎂鹽、錳鹽、鈣鹽。
[0013]在其中一些實施例中，步驟(I)所述瓊脂-Ml7培養(yǎng)基中的瓊脂含量為I?2wt%，活化的時間為12h?60h，活化的溫度為20 0C?45 °C。
[0014]在其中一些實施例中，步驟(2)所述液體培養(yǎng)基為Ml7肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)的時間為12h?196h，培養(yǎng)的溫度為20°C?45°C，培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為Orpm?280rpm。
[0015]在其中一些實施例中，步驟(3)將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液按體積比為0.1%?10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為20°C?45°C，發(fā)酵培養(yǎng)的時間為12h?196h，發(fā)酵培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為Orpm?280rpm。
[0016]在其中一些實施例中，步驟(2)和/或步驟(3)的培養(yǎng)在嚴格厭氧的條件下進行。
[0017]在其中一些實施例中，步驟(4)所述溶菌酶的質(zhì)量為步驟(3)所得發(fā)酵濕菌體質(zhì)量的0.1m
[0018]本發(fā)明的另一目的在于提供一種細菌超氧化物歧化酶。
[0019]具體技術(shù)方案如下:
[0020]一種細菌超氧化物歧化酶，由上述制備方法制備而得。
[0021 ] 本發(fā)明利用格氏乳球菌(Lactococcus garviea，保藏編號為CCTCC M 2015633)進行發(fā)酵培養(yǎng)制備細菌超氧化物歧化酶，本發(fā)明的制備方法制備得到的細菌超氧化物歧化酶的酶活力高(20230U/g凍干菌粉以上)，熱穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性均很好，且該方法制備過程簡單、成本低、產(chǎn)量高、應(yīng)用廣泛。且發(fā)明人對制備方法進行了優(yōu)化，厭氧條件下培養(yǎng)更有利于格氏乳球菌的生長以及細菌超氧化物歧化酶的產(chǎn)生，得到的細菌超氧化物歧化酶具有更高的酶活力(達到32450U/g凍干菌粉)。
【具體實施方式】
[0022]以下將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0023]以下實施例中，未注明具體條件的實驗方法，按本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)方法和條件進行。格式乳球菌839 (Lactococcus garviea 839)保藏在中國武漢武漢大學，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2015年10月22日，保藏編號CCTCC NO: M 2015633。
[0024]實施例1
[0025]本實施例的一種細菌超氧化物歧化酶的制備方法，包括以下步驟:
[0026](I)格氏乳球菌的活化:將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接種于2界1:%瓊脂-Ml 7培養(yǎng)基中進行活化，活化溫度為20 0C，時間為48h;
[0027](2)格氏乳球菌種子液的制備:將活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接種于M17肉湯培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為lOOrpm，得到格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液；
[0028](3)格氏乳球菌的發(fā)酵培養(yǎng):將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液按體積比為I %的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中有氧發(fā)酵培養(yǎng)144h，溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為10rpm;離心收集發(fā)酵濕菌體并把發(fā)酵濕菌體凍干得到凍干菌粉;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:0.1wt %的葡萄糖，Iwt %的蛋白胨，0.1wt %硫酸氫二鉀，0.1wt %硫酸鎂，余量為蒸餾水；
[0029](4)超氧化物歧化酶的制備:將步驟(3)收集的凍干菌粉，懸浮于pH 7.8的磷酸緩沖液中，加入溶菌酶(質(zhì)量為步驟(3)所得發(fā)酵濕菌體質(zhì)量的1%)裂解24h后1000rpm離心1111；[11，得到的上清液用101]11]101凡的鹽酸調(diào)。!1到4.0，冰冷放置211，12000印1]1下離心1111；[11除沉淀，上清液即為SOD酶液，并將上清液凍干即得SOD酶粉;測其酶活。
[0030]SOD活性測定方法:總超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用鄰苯三酚自氧化法，以每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定義為一個酶活單位(U)。
[0031 ] 自氧化的測定:在25°C，在4.5mL 50mmol/L，pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液中加入10yL50mmol/L的鄰苯三酚，迅速搖勻，倒入比色皿，以Tris-HCl緩沖溶液為空白對照，在325nm波長下每隔30s測一次吸光度(A值)，共測6次，要求自氧化速率控制在0.0700D/min左右。
[0032]酶活的測定:在25°C，在4.5mL 50mmol/L，pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液中加入一定量的待測超氧化物歧化酶酶液，預(yù)熱20min，加入1yL 50mmol/L的鄰苯三酸，迅速搖勾，倒入比色皿，以Tris-HCl緩沖溶液為空白對照，在325nm波長下每隔30s測一次A值，共測6次。
[0033]SOD單位活力(U/ml) = (Ao-As)/(AsX50% ) X4.5/VXN
[0034]式中:Ao為自氧化速率;As為加入待測SOD酶液后的氧化速率;V為加樣體積;N為樣品稀釋倍數(shù)。
[0035]在步驟(3)中，IL發(fā)酵培養(yǎng)基得15.8g凍干菌粉，經(jīng)測定步驟(4)S0D酶液凍干后質(zhì)量為986mg，SOD活性為25650U/g凍干菌粉。
[0036]實施例2
[0037 ]本實施例的一種細菌超氧化物歧化酶的制備方法，包括以下步驟:
[0038](I)格氏乳球菌的活化:將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接種于2*1:%瓊脂_Ml 7培養(yǎng)基中進行活化，活化溫度為20 0C，時間為12h;
[0039](2)格氏乳球菌種子液的制備:將活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接種于M17肉湯培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)196h，培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為Orpm，得到格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液；
[°04°] (3)格氏乳球菌的發(fā)酵培養(yǎng):將格氏乳球菌(Lactococcus g