一種催化效率提高的β-葡萄糖苷酶突變體F67Y及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種催化效率提高的β-葡萄糖苷酶突變體 F67Y及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 能源短缺是人類面臨的重大問題之一。而對于纖維素的利用是解決能源危機、糧 食短缺、環(huán)境污染的重要途徑。葡萄糖苷酶則是當今生物乙醇生產(chǎn)過程中最重要的工具 酶之一。纖維素是多個葡萄糖殘基以β-1，4_糖苷鏈連接而成的多聚物，是地球上最豐富的 可再生的生物質(zhì)資源。纖維素酶是能夠?qū)⒗w維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖的一系列酶的總稱，主要包 括內(nèi)切葡聚糖酶（endo-β-Ι，4_glucanase，EC 3 · 2 · 1 · 4)、外切葡聚糖酶（exoglucanase， EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)。內(nèi)切葡聚糖酶作用于纖維素 長鏈分子的內(nèi)部將長纖維切成短纖維，外切葡聚糖酶作用于纖維素分子的一端，以兩個葡 萄糖殘基為單位進行切割生成纖維二糖，葡萄糖苷酶切割纖維二糖及一些纖維寡糖最終 生成單個的葡萄糖分子。
[0003] β-葡萄糖苷酶可水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-糖苷鍵，同時釋放β-D-葡萄糖和 相應(yīng)的配基。此外，葡萄糖苷酶還能微弱水解對硝基苯-β-D-半乳糖和β-D-木糖苷。作為 纖維素復合酶系的重要組成之一，葡萄糖苷酶的關(guān)鍵作用主要體現(xiàn)在消除纖維二糖積累 對其上游內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性的反饋抑制作用。因此，葡萄糖苷酶的高 效水解對纖維素的徹底降解起到至關(guān)重要的作用，而葡萄糖單糖的高轉(zhuǎn)化率對于生物乙醇 生產(chǎn)中的乙醇發(fā)酵過程極其有力。由此可見，提高β-葡萄糖苷酶在纖維素降解體系的催化 活性，對于提高纖維素降解體系轉(zhuǎn)化效率及降低纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)成本，具有巨大的商 業(yè)價值和現(xiàn)實意義。
[0004] 高比活、高催化效率是幾乎所有工業(yè)用途對β-葡萄糖苷酶的要求，而這類β-葡萄 糖苷酶的工程菌株的獲得主要通過誘變、篩選和酶分子改良獲得。本發(fā)明提供高溫酸性β-葡萄糖苷酶具突變體，具有更高的催化效率，提升應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供了一種高催化效率β-葡萄糖苷酶突變體F67Y。
[0006] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述高催化效率β-葡萄糖苷酶突變體F67Y的基因。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供包含上述突變體基因的重組載體。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0009] 本發(fā)明以來源于嗜熱真菌籃狀菌Talaromyces leycettanus JCM12802的酸性β-葡萄糖苷酶為母本，采用分子生物學技術(shù)對酸性葡萄糖苷酶序列進行區(qū)域替換后表達。 [0010]根據(jù)本發(fā)明的高催化效率β-葡萄糖苷酶突變體，是β-葡萄糖苷酶的催化活性通道 loop區(qū)域替換后得到的突變體，即β-葡萄糖苷酶的67位氨基酸由苯丙氨酸"F"突變?yōu)槔野?酸"γ"
[0011] 所述高催化效率β_葡萄糖苷酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] YGFGGSGWDAAYGRAKAALNKLNQTEKVGIVTGVKWMGGPCVGNTYKPSSIDYPSLCLQDSPLGVRYANPVTAFPAG INAGATWDRSLINARGAAMGAEAKGLGVNVQLGPVAGPLGKNPNSGRIWEGFSNDPYLSGVAMEETIAGMQGSGVQA CAKHYIGNEQEHNRETISSNIDDRTLHELYVWPFMNAVKANVASVMCSYNEVNGSWSCENDALLNGLLKTELGFPGY IMSDWNAQHTTVNSANSGLDMTMPGSDFNNPPGSIYWGPNLEAAVANGSVPQSRLDDMVTRILASWYLVGQDEGYPP VAFSSWNGGKANVDVTCDHKSWRAVARDSIVLLKNDNNALPLRKPKSLAIIGQDATVNPAGPNACSDRGCDTGTLA MGWGSGTAQFPYIVGPLDAIQSQAAADGTNITTSTTDDTTAAASAAASAGTAIVFINSDSGEGYITVEGNAGDRNNL DPWHNGNELVQAVAAVNKNVIVVVHSVGPVILEAILAQPNVKAIVWPGLPGQESGNALVDVLYGSTSPSGKLPYTIA KQFSDYGTTWTTSLVDDFTEGLFIDYRHFDENNITPRYEFGYGLSYTTFKYSDLDVNVQARPGAAEGPIVPGGVKEL FDTVGTVTVTVQNSGKVAGAEVAQLYIGLPDSAPSTPPKQLRGFQKLHLAPGQREGATFELTRRDISYWDVQQQKWV VPSGTFKVYVGSSSRDIREQGSFRI
[0013] 編碼高催化效率β-葡萄糖苷酶突變體的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014] TATGGCTTCGGCGGCTCTGGCTGGGACGCCGCTTATGGCAGAGCAAAGGCTGCGCTGAACAAGCTCAACCAGACCGA GAAGGTTGGTATCGTCACCGGTGTCAAGTGGATGGGCGGCCCTTGTGTTGGCAACACCTACAAGCCCAGTTCGATTG ACTACCCTTCTCTGTGTTTGCAAGACTCTCCTCTCGGGGTGCGTTACGCCAACCCTGTGACTGCCTTCCCGGCTGGT ATCAACGCCGGCGCCACATGGGATAGATCTCTCATCAACGCCCGTGGTGCGGCCATGGGCGCTGAGGCCAAGGGCCT CGGTGTGAACGTCCAGCTTGGCCCCGTCGCTGGTCCTCTCGGCAAGAATCCCAATAGTGGCAGAATCTGGGAAGGGT TCTCGAATGATCCCTATCTCAGCGGTGTTGCGATGGAGGAAACCATCGCCGGAATGCAAGGATCTGGTGTGCAGGCC TGCGCCAAGCACTATATTGGTAACGAGCAAGAGCACAACCGTGAAACCATCAGCTCCAACATCGATGACCGCACTCT GCACGAGCTCTACGTCTGGCCGTTCATGAACGCCGTCAAGGCCAACGTCGCCTCCGTCATGTGCTCGTACAACGAGG TCAATGGTTCCTGGTCCTGTGAGAATGATGCTCTTCTCAACGGTCTGTTGAAGACTGAGCTCGGATTCCCCGGATAC ATCATGAGCGATTGGAACGCGCAGCACACCACGGTCAACAGCGCCAACTCGGGTCTCGATATGACCATGCCTGGCAG TGACTTCAACAACCCTCCTGGCAGCATCTACTGGGGGCCCAACCTCGAAGCCGCCGTCGCCAATGGCTCCGTTCCGC AGTCCCGTTTGGACGACATGGTCACTCGTATCCTTGCGTCTTGGTACTTGGTTGGCCAGGATGAGGGCTACCCACCG GTCGCCTTCAGCTCCTGGAATGGCGGCAAGGCCAATGTTGACGTGACGGGCGATCACAAGAGCGTCGTCAGAGCTGT GGCTCGTGACTCTATCGTTCTTCTGAAGAACGACAATAACGCTTTGCCTCTGCGCAAGCCCAAGAGCCTCGCGATCA TCGGCCAGGATGCAACTGTCAACCCTGCCGGGCCCAACGCTTGCTCTGATCGCGGCTGCGACACCGGTACTCTCGCC ATGGGTTGGGGCAGTGGTACCGCTCAGTTCCCATACATCGTCGGCCCTCTCGATGCTATCCAGTCTCAGGCTGCCGC TGATGGCACTAACATCACCACCAGCACGACCGATGATACCACCGCGGCAGCTTCTGCAGCCGCCTCCGCCGGAACCG CCATCGTCTTCATCAACTCCGACTCTGGTGAAGGTTACATCACCGTCGAGGGCAACGCTGGTGACCGCAACAACCTC GACCCCTGGCACAACGGCAACGAGCTCGTCCAGGCCGTTGCGGCTGTGAACAAGAATGTCATTGTCGTTGTCCACAG CGTCGGTCCCGTGATCTTGGAGGCTATCCTTGCACAGCCCAACGTCAAGGCCATTGTGTGGCCCGGTCTCCCTGGAC AAGAGAGCGGCAATGCCCTGGTCGATGTTCTGTACGGCTCCACCTCCCCCAGCGGCAAGTTGCCCTATACCATTGCC AAGCAGTTCAGCGACTATGGCACCACCTGGACGACCTCCCTGGTCGATGACTTCACCGAGGGTCTGTTCATTGACTA CCGCCACTTTGACGAGAACAACATTACTCCCAGATACGAGTTCGGATACGGCTTGTCTTACACCACCTTCAAATACT CCGACCTGGACGTCAACGTCCAGGCCCGCCCCGGCGCAGCCGAAGGCCCCATCGTCCCCGGCGGCGTCAAGGAACTT TTCGACACCGTCGGCACCGTCACCGTCACCGTCCAGAACAGCGGCAAGGTTGCCGGCGCGGAAGTTGCCCAGCTGTA CATCGGCCTTCCCGACTCTGCCCCGTCGACCCCTCCCAAGCAGCTCAGAGGATTCCAGAAGTTGCACCTCGCGCCCG GCCAGAGAGAGGGCGCCACTTTCGAACTCACCCGCCGAGACATCAGCTACTGGGACGTTCAGCAGCAGAAGTGGGTT GTTCCTAGCGGTACGTTCAAGGTCTATGTTGGAAGCTCGAGCAGGGACATTAGGGAGCAGGGATCTTTCCGTATTTG A
[0015] 本發(fā)明還是提供一種制備高催化效率β-葡萄糖苷酶的方法：
[0016] 1)采用over-lap PCR的方法擴增高催化效率β-葡萄糖苷酶突變體基因序列；
[0017] 2)將催化效率β-葡萄糖苷酶突變體序列片段克隆到表達載體pPIC 9r上，重組載 體命名 pPIC9r-A-F67Y;
[0018] 3)將突變體重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，誘導表達，獲得突變株，優(yōu)選為GS115/ A-F67Y〇
[0019] 本發(fā)明還提供了包含上述β-葡萄糖苷酶突變體基因的重組載體，優(yōu)選為pPIC9r-A-F67Y。將本發(fā)明的β-葡萄糖苷酶突變體基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之 間，使其核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方 案，優(yōu)選為將葡萄糖苷酶基因插入到質(zhì)粒pPIC9r上的EcoR I和Not I限制性酶切位點之 間，得到重組表達質(zhì)粒pP