細菌噬菌體基因組dna提取試劑盒及方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物核酸提取技術領域，具體涉及一種細菌噬菌體基因組DNA提取試劑盒以及使用該試劑盒提取細菌噬菌體基因組DNA的方法。
【背景技術】
[0002]B蜜菌體是一類以細菌為宿主的病毒。跟別的病毒一樣，B蜜菌體只是一團由蛋白質外殼包裹的遺傳物質，大部分噬菌體還長有“尾巴”，用來將遺傳物質注入宿主體內。噬菌體是一種普遍存在的生物體，而且經常都伴隨著細菌。通常在一些充滿細菌群落的地方，如:河水、泥土、動物的內臟里，都可以找到噬菌體的蹤影。噬菌體被認為是地球上含量最為豐富的生物種類。
[0003]噬菌體只含有DNA或RNA中的一種遺傳物質，絕大部分的噬菌體的遺傳物質是DNA。近二十年來，隨著分子生物學技術的進步，噬菌體的研究變得越來越熱門，主要原因在于幾個方面:第一，細菌的耐藥問題日趨嚴重使曾經被寄予希望的噬菌體治療再次進入研究者的視野;第二，微生物基因組測序技術的發(fā)展使人們發(fā)現(xiàn)細菌基因組中廣泛存在著噬菌體的痕跡，顯示出噬菌體在細菌基因組進化中扮演著非常重要的角色;第三，一些嚴重威脅人類健康的致病株的致病性都與前噬菌體有關;第四，噬菌體在細菌分型、檢測、噬菌體展示、細菌重組工程、發(fā)展新的遺傳學操作工具領域都有廣泛的應用。
[0004]提取噬菌體基因組DNA是進行基于分子技術研究噬菌體的基礎;此外在日益增加的噬菌體基因組測序要求中，最關鍵的一步也要求提取高質量、具有一定濃度并且不受宿主核酸污染基因組DNA，目前還沒有可廣泛使用的細菌噬菌體基因組DNA提取方法及試劑盒，但是微生物領域卻存在對細菌噬菌體基因組DNA提取方法及試劑盒的強烈需求，通用的細菌噬菌體基因組DNA提取方法及試劑盒的出現(xiàn)必將大大減少技術人員的操作時間，加快相關領域的研究進程。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種可以廣泛使用的細菌噬菌體基因組DNA提取試劑盒及方法，從而填補沒有可廣泛使用的噬菌體基因組DNA提取試劑盒及方法的技術空白。
[0006]本發(fā)明的細菌噬菌體基因組DNA提取試劑盒，包括以下試劑:
[0007](I)試劑A:氯仿；
[0008](2)試劑B:用TE緩沖液配制的10-20mg/ml的DNase I，_20°C保存；
[0009](3)試劑C:用TE緩沖液配制的10-20mg/ml的RNase A，_20°C保存；
[0010](4)試劑D:為沉淀緩沖液，含300-400mg/ml的聚乙二醇-8000(PEG-8000)和3MNaCl，無菌水配制，室溫保存；
[0011](5)試劑E:為裂解緩沖液，每升含有5.8g NaCl、1.23g MgSO4.7出0、50ml的IMpH8.(^9Tris-Cl(lM Tris，pH調整8.0)和 100ml 0.05mol EDTA，水為溶劑，高壓滅菌20min;
[0012](6)試劑F:為主裂解液，150-200mg/ml的十二烷基苯磺酸鈉(SDS)，水為溶劑；
[0013](7)試劑G:為副裂解液，用TE緩沖液配制的15-25mg/ml的蛋白酶K，4 °C保存；
[0014](8)試劑H:為雜質去除液，5-6M NaCl，溶劑為水；
[0015](9)試劑1:為DNA結合緩沖液，含6-7M異硫氰酸胍(GuSCN)和10mM Tris,pH 6.4；,溶劑為水；
[0016](10)試劑J:為漂洗緩沖液，由5-10mM pH 8.0的Tris-Cl與無水乙醇按1:4的體積比混合而成；
[0017](11)試劑K:為DNA洗脫液，5-1 OmM pH 8.0的Tris-Cl;
[0018]所述的TE緩沖液含有1mM三羥基甲基氨基四烷(Tris)和ImM乙二酸四乙酸(EDTA)，ρΗ 8.0ο
[0019]本發(fā)明的主要原理為:噬菌體裂解細菌后，釋放到培養(yǎng)基中，以少量的試劑A(氯仿)殺死殘存的細菌，并且可以促進培養(yǎng)基中脂質物質的分離；高速離心后，細菌細胞及細胞碎片沉淀，而噬菌體以及細菌自身的DNA和RNA仍然保留在培養(yǎng)液上清中；加入足量的試劑B (DNase I)和試劑C (RNase A)后，細菌自身的DNA和RNA受到降解破壞;試劑D中的NaCl、PEG-8000具有強烈的奪水能力，在高鹽、高PEG-8000以及低溫環(huán)境下，噬菌體粒子因奪水能力弱而逐漸沉降下來，再次離心去掉上清，沉淀的即為噬菌體粒子;噬菌體粒子的主要成分為蛋白和核酸，在試劑F (SDS)的作用下，噬菌體粒子的結構被破壞，在SDS以及試劑G (含蛋白酶K)的共同作用下，衣殼蛋白溶解，內部的基因組DNA釋放出來;加入試劑H則提供了高濃度的NaCl環(huán)境，有利于殘存的各種雜質沉淀。試劑I的主要成分為GuSCN，為一種高離液劑，試劑I提供一種高離液、低PH的環(huán)境，在這種環(huán)境下DNA可以與硅膠膜發(fā)特異性吸附，而雜質不能吸附，通過離心可以去除;在低濃度的緩沖液(如試劑I)或水中DNA又從硅膠膜釋放，從而達到分離純化目的。
[0020]因此，本發(fā)明還提供了細菌噬菌體基因組DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0021]接種噬菌體裂解細菌后得到細菌的噬菌體裂解物，然后加入氯仿殺死殘存的細菌和促進脂質物質的分離，再離心使細菌細胞和細胞碎片沉淀，取上清，在上清中加入DNaseI和RNase A，降解細菌本身的DNA和RNA，然后再加入含有聚乙二醇-800和NaCl的溶液，使噬菌體沉降，然后再離心去除上清，沉淀即為噬菌體粒子，然后再提取噬菌體的基因組DNA。
[0022]優(yōu)選，具體方法如下:
[0023](I)細菌菌體及其碎片去除:細菌過夜培養(yǎng)后，按體積分數(shù)2 %接種于LB新鮮培養(yǎng)基，加入體積分數(shù)2 %的噬菌體液，37 °C振蕩培養(yǎng)4-6小時，即獲得細菌的噬菌體裂解物;取細菌的噬菌體裂解物10-201111，加入試劑4使其終濃度為體積分數(shù)1%，4°(:1000(^離心1min;
[0024](2)細菌核酸降解:小心取上清，用0.45μπι濾膜過濾，取濾液向其中加入10_20yL試劑B及10-20yL試劑C，混勻，37 °C溫育30min;
[0025](3)細菌噬菌體粒子沉淀:加入5-10ml試劑D，輕柔上下混合，冰上放置60min以上或4°C過夜放置;1000g，4°C離心1min，小心棄去上清，得細菌噬菌體粒子沉淀；
[0026](4)細菌噬菌體衣殼蛋白結構破壞和水解:向細菌噬菌體粒子沉淀中依次加入250-500yL試劑E、50-100yL試劑F和1.5-3yL試劑G，50°C溫育30min;
[0027](5)雜質去除:加入100-200yL試劑H，輕柔混勻4-6次，12000g離心lOmin，取上清；
[0028](6)DNA離液:加入步驟(5)所取上清二分之一體積的試劑I，上下輕輕顛倒混勻6_8次得混合液；
[0029](7)DNA吸附:將DNA吸附柱放置在離心管中，將上述步驟(6)中的混合液移入DNA吸附柱，12000g離心lmin，棄去過濾液；
[0030](8)吸附DNA清洗:向DNA吸附柱中加入600-700yL試劑J，12000g離心lmin，棄去過濾液;再次加入600-700yL試劑J，12000g離心Imin，棄去過濾液，將DNA吸附柱室溫放置2-5min；
[0031](9)吸附DNA洗脫:將DNA吸附柱轉移到一支新的離心管中，加入50-1 OOyL試劑K于DNA吸附柱的膜中央，室溫放置l_2min; 12000g離心Imin，取洗脫液即得到細菌噬菌體基因組 DNA。
[0032]優(yōu)選，所述的細菌噬菌體為溶藻弧菌噬菌體ΦΡΕ333、大腸桿菌噬菌體ΦΡ1655或陰溝腸桿菌噬菌體Φ PZJ02。
[0033]優(yōu)選，所述的DNA吸附柱購自寧波重鼎生物技術有限公司。
[0034]本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果:(I)提取迅速，最快可以在2個小時內完成提?。?2)提取產量高，純度高，提取基因組的DNA濃度達到10ngAiL以上，一次提取可滿足PCR、基因組測序等分子實驗需求；(3)提取產物不受宿主菌基因組DNA污染，因而根除了宿主基因組DNA的干擾。
【附圖說明】
[0035]圖1是實施例1-3中提取的三種噬菌體基因組DNA電泳圖。圖中:M，分子量MarkerA-Hind III digest； I，溶藻弧菌.菌體ΦΡΕ333;2，大腸桿菌.菌體ΦΡ1655;3，陰溝腸桿菌噬菌體(DPZJ02。
[0036]圖2是對提取的噬菌體基因組DNA是否有宿主基因組DNA污染的PCR檢測。圖中:Μ，分子量Marker DL2000 ； I，溶藻弧菌基因組DNA陽性對照；2，噬菌體ΦPE333基因組DNA; 3，大腸桿菌基因組DNA陽性對照;4，噬菌體Φ P1655基因組DNA; 5，陰溝腸桿菌基因組DNA陽性對照;6，噬菌體Φ PZJ02基因組DNA;采用的靶基因為宿主菌保守看家基因gyrB，采用的擴增引物為gyrB擴增通用引物對gyrB-UF/gyrB_UR。
【具體實施方式】
[0037]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0038]下列實施例中未注明的具體實驗條件和方法均為采用本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
[0039]以下實施例中所采用的DNA吸附柱購自寧波重鼎生物技術有限公司。
[0040]實施例1:提取溶藻弧菌噬菌體ΦΡΕ333基因組DNA
[0041]按以下配方配制試劑:
[0042](I)試劑A:氯仿；
[0043](2)試劑B:用TE緩沖液配制的20mg/