可分泌型trail蛋白構(gòu)建物和表達(dá)載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因重組和蛋白表達(dá)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種可分泌型TRAIL蛋白構(gòu) 建物和其表達(dá)載體，具體的，提供了一種可表達(dá)分泌型TRAIL蛋白構(gòu)建物和慢病毒表達(dá)載 體。本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體可在宿主細(xì)胞中表達(dá)TRAIL蛋白分子，并可將表達(dá)的TRAIL 蛋白分泌至宿主細(xì)胞外的培養(yǎng)液中，便于收集和純化，以及更有效地在需要TRAIL蛋白的 個體的體內(nèi)發(fā)揮TRAIL蛋白的生理生化作用。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥和惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的最主要疾病之一，每年的發(fā)病率和 死亡率都在逐漸攀升，世界各個國家的衛(wèi)生組織，都對癌癥和惡性腫瘤給予越來越多的關(guān) 注。目前對于癌癥和惡性腫瘤的治療中，化療、放療和手術(shù)治療依然是臨床最常使用的主要 手段。手術(shù)治療受病灶部位限制，而化療和放療的副作用顯著，不僅對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制， 也對正常細(xì)胞和組織產(chǎn)生嚴(yán)重殺傷作用，因此臨床使用上受到嚴(yán)重限制。需要新的有效的 低副作用的抗腫瘤制劑出現(xiàn)。
[0003] 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand, TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族中的一員。參見W097/33899 和Wiley, S.R.等，Immunity 3:673-682(1995)。TRAIL主要通過與細(xì)胞表面的死亡受體 (DR4和DR5)結(jié)合，啟動外源性凋亡途徑，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。并且，該凋亡誘導(dǎo) 活性主要是針對腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞不產(chǎn)生殺傷作用，因此具有一定腫瘤特異性。獲得 TRAIL蛋白最經(jīng)濟(jì)的方式是基因工程表達(dá)純化，目前多用的表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌原核表 達(dá)系統(tǒng)和細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)。由于TRAIL蛋白是哺乳動物起源，因此真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具 有更好的兼容性。
[0004] 真核細(xì)胞表達(dá)TRAIL蛋白過程中有兩個問題需要解決。1. TRAIL的可分泌性：一 般的真核細(xì)胞表達(dá)載體缺乏有效的分泌型信號肽序列，不能將表達(dá)的目的蛋白輸送到細(xì)胞 外培養(yǎng)基當(dāng)中去，而是累積在細(xì)胞內(nèi)部，一方面影響了目的蛋白的積累，另一方面也為后續(xù) 分離純化過程增加了困難。2.構(gòu)建的基因工程細(xì)胞基因穩(wěn)定性：普通真核細(xì)胞表達(dá)載體， 將目的基因片段帶入宿主細(xì)胞基因組中后，并不能穩(wěn)定存在，目的基因隨著宿主細(xì)胞傳代 分裂過程會逐漸丟失，因此需要不斷的抗生素選擇和單克隆細(xì)胞篩選。
[0005] 本領(lǐng)域仍需要更好的在體內(nèi)或體外表達(dá)TRAIL蛋白的表達(dá)載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種用于構(gòu)建可分泌型TRAIL蛋白表達(dá)載體的核苷酸構(gòu)建體。本 發(fā)明還提供了可表達(dá)分泌型TRAIL蛋白的表達(dá)載體，該載體可穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染哺乳動物宿主細(xì) 胞，并可將表達(dá)的TRAIL蛋白分泌到宿主細(xì)胞外的細(xì)胞培養(yǎng)液中，便于后續(xù)的收集，分離和 純化。
[0007] 本發(fā)明提供了一種核苷酸分子，其包括如SEQ ID N0 :1所示序列中第7-930位的 核苷酸序列。其中，SEQ ID NO :1的第91-930位的核苷酸序列編碼TRAIL蛋白。本發(fā)明的 所述核苷酸分子為DNA構(gòu)建體，具體的，為可分泌型TRAIL表達(dá)構(gòu)建體，可用于插入到合適 的載體中，形成表達(dá)可分泌型TRAIL蛋白的表達(dá)載體。在本發(fā)明的其中一個方面，本發(fā)明的 核苷酸分子的核苷酸序列為如SEQ ID NO :1的第7-930位所示。
[0008] 氨基酸是由多核苷酸編碼的。多核苷酸中的信使RNA鏈上決定一個氨基酸的相鄰 的三個堿基叫做一個"密碼子"，亦稱三聯(lián)體密碼。同一種氨基酸可以由幾個不同的密碼子 來決定。本發(fā)明的核苷酸分子還包括其核酸序列中的對應(yīng)SEQ ID N0 :1的第91-930位編 碼TRAIL蛋白的核酸序列與SEQ ID N0 :1的第91-930位不同，但符合氨基酸編碼簡并性， 也可表達(dá)SEQ ID N0 :1的第91-930位編碼的TRAIL蛋白的核苷酸分子。
[0009] 本發(fā)明的核苷酸分子還包括其核酸序列中的對應(yīng)SEQ ID N0 :1的第91-930位的 核酸序列與SEQ ID N0 :1的第91-930位不同，但可編碼與SEQ ID N0 :1的核苷酸序列中第 91-930位編碼的TRAIL蛋白具有相同或相似的活性的蛋白的核苷酸分子，所述具有相同或 相似的活性的蛋白與SEQ ID N0 :1的核苷酸序列中第91-930位編碼的TRAIL蛋白比較，在 其氨基酸序列中可引入了一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基 酸序列，但保持和具有TRAIL蛋白的活性。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種含有上述本發(fā)明的核苷酸分子的載體。所述載體可為能夠獨 立復(fù)制并具有選擇標(biāo)記的載體，如質(zhì)粒、噬菌體和病毒等。根據(jù)載體的性質(zhì)不同，可采用轉(zhuǎn) 染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式，將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，并使其大量繁殖。合適的基因工程 宿主是本領(lǐng)域公知的，可以是大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞等。在本發(fā)明的其中一個方面，其中 所述載體為病毒載體，其中所述核苷酸分子可表達(dá)地插入到所述病毒載體中。在本發(fā)明的 其中一個方面，本發(fā)明的載體可轉(zhuǎn)染哺乳動物宿主細(xì)胞和表達(dá)TRAIL蛋白，并且所述TRAIL 蛋白可分泌到宿主細(xì)胞外。
[0011] 在本發(fā)明的其中又一個方面，所述載體為慢病毒載體，其中所述的核苷酸分子可 表達(dá)地克隆入慢病毒表達(dá)載體pLVTHM。
[0012] 本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，所述方法包括用前述本發(fā)明的核苷酸分子或載 體來轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明還提供了包含前述本發(fā)明的核苷酸分子或載體的哺乳動物細(xì)胞。
[0014] 本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)TRAIL蛋白的方法，所述方法包括用前述本發(fā)明的核苷 酸分子或載體來轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞，在所述哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)TRAIL蛋白，所述TRAIL蛋 白可分泌到宿主細(xì)胞外的培養(yǎng)液中。
[0015] 本發(fā)明提供的可分泌型TRAIL表達(dá)構(gòu)建體中，包括了高效的分泌信號肽序列和其 它表達(dá)操控元件序列，可使位于其下游的TRAIL蛋白編碼基因表達(dá)的TRAIL蛋白分子在表 達(dá)后能夠分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中。特別是當(dāng)本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體被克隆到慢病毒載體，例 如慢病毒表達(dá)載體PLVTHM中，能夠在哺乳動物細(xì)胞中高效和穩(wěn)定地表達(dá)TRAIL蛋白分子。 本發(fā)明提供的表達(dá)可分泌型TRAIL蛋白的慢病毒載體，利用慢病毒的特點將TRAIL蛋白表 達(dá)基因穩(wěn)定的整合在宿主細(xì)胞的基因組中，不易丟失。由此，本發(fā)明提供的表達(dá)可分泌型 TRAIL蛋白的慢病毒載體和生產(chǎn)、分離、純化TRAIL蛋白的方法，既方便了后續(xù)的純化提取， 省略了細(xì)胞破碎的過程；又避免表達(dá)的TRAIL蛋白在細(xì)胞內(nèi)被胞內(nèi)蛋白酶水解，因此可以 顯著提高蛋白表達(dá)效率。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明的可分泌型TRAIL蛋白構(gòu)建體的一種實施方式的核苷酸序列；
[0017] 圖2為本發(fā)明的可分泌型TRAIL蛋白表達(dá)基因片段的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0018] 圖3經(jīng)雙酶切回收的慢病毒表達(dá)載體pLVTHM質(zhì)粒片段的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0019] 圖4為HEK293細(xì)胞經(jīng)慢病毒包裝三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48小時后的熒光顯微照片圖；
[0020] 圖5為慢病毒顆粒感染MSC細(xì)胞的熒光和白光顯微照片圖；
[0021] 圖6為檢測TRAIL蛋白的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0022] 圖7為MTS法檢測感染了慢病毒的MSC細(xì)胞上清液條件培養(yǎng)基對U87腫瘤細(xì)胞的 生長抑制作用圖。
【具體實施方式】
[0023] 為了更好地理解和闡釋本發(fā)明，下面將參照附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0024] 實施例1
[0025] 1、編碼可分泌型TRAIL蛋白構(gòu)建體的制備
[0026] 合成具有SEQ ID NO : 1 (如圖1所示）的核苷酸序列的雙鏈DNA分子。該DNA分 子包含本發(fā)明的核苷酸分子，其核苷酸序列為如SEQ ID N0 :1所τκ序列中第7-930位的核 苷酸序列。在合成的DNA分子中，其兩端的六個核苷酸分別是額外增加的用于構(gòu)建載體的 限制性核酸內(nèi)切酶Cla I和Mlu I的酶切位點。
[0027] 2、雙鏈DNA分子的雙酶切和膠回收
[0028] 合成的雙鏈DNA分子經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Cla I和Mlu I (NEB公司）充分消化。 消化產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，以Qiagene公司的膠回收試劑盒純化約930bp片段。
[0029] 圖2為經(jīng)雙酶切回收的可分泌型TRAIL蛋白表達(dá)基因片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。 該基因片段約為930bp。圖中右側(cè)為目的DNA條帶，左側(cè)為使用的Invitrogen公司1Kb Plus DNA ladder 分子量 marker。
[0030] 實施例2可分泌型TRAIL慢病毒表達(dá)載體pLVTHM-seTRAIL的構(gòu)建
[0031] 1、pLVTHM載體的雙酶切
[0032] 將 pLVTHM 載體質(zhì)粒（Addgene，cat. no.為 Plasmid 12247)DNA 經(jīng) NEB 公司的限制 性核酸內(nèi)切酶Cla I和Mlu I充分消化，消化產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析，以Qiagene 公司的膠回收試劑盒純化約7500bp的片段。
[0033] 圖3為經(jīng)雙酶切回收的慢病毒表達(dá)載體pLVTHM質(zhì)粒DNA電泳圖，基因片段約為 11，OOObp，右側(cè)為目的DNA條帶，左側(cè)為使用的Invitrogen公司1Kb Plus DNA ladder分 子量 marker。
[0034] 2、酶切產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化
[0035] 將實施例1經(jīng)過酶切回收的約930bp小片段DNA和實施例第1步經(jīng)同樣酶切回 收的約11，ooobp大片段質(zhì)粒DNA以5:1的摩爾比例混合，并以NEB公司的T4DNA連接酶 16°C連接過夜，構(gòu)建成表達(dá)載體pLVTHM-seTRAIL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì) 胞（轉(zhuǎn)化操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史密斯， K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實驗指南》美國紐約John Wiley&Sons出版社1995年第三版 P39-40)，以氨卞青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子。
[0036] 3、表達(dá)載體 pLVTHM-seTRAIL 的驗證
[0037] 將挑選的陽性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培，提取質(zhì)粒DNA (質(zhì)粒DNA提取方法按J.薩姆布魯克， E.F.費里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆實驗指南》美國紐約冷泉港出版社2001年第三版 P27-30)，并以Sanger雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA測序證實連接正確。
[0038] 實施例3表達(dá)可分泌型TRAIL慢病毒顆粒的包裝
[0039] 1、表達(dá)質(zhì)粒pLVTHM-seTRAIL和輔助質(zhì)粒濃度和純度的測定
[0040] 采用第二代慢病毒包裝系