一種采用一步法進(jìn)行DNA末端修復(fù)/加dA的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用一步法進(jìn)行DNA末端修復(fù)/加 dA的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基于Illumina平臺(tái)的下一代測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)中，需要測(cè) 序的DNA必須首先均勻截?cái)酁橐欢ㄩL(zhǎng)度，然后在其兩段添加上測(cè)序必須的接頭，完成DNA文 庫(kù)的制備。
[0003] 超聲波打斷或能夠隨機(jī)切割雙鏈DNA的酶混合物是目前應(yīng)用最為廣泛的DNA打斷 方法。通過(guò)這些方法打斷形成的DNA，其兩段的狀態(tài)具有異質(zhì)性，帶有5凸出或3凸出。對(duì) 于超聲波打斷的DNA，其5'和3'末端的磷酸基團(tuán)或羥基基團(tuán)也不一定。為了將這些末端異質(zhì) 性的DNA片段兩端均添加上測(cè)序必須的接頭，必須對(duì)末端進(jìn)行修復(fù)，使其成為滿足接頭連接 的一致形式。
[0004] 針對(duì)DNA末端的異質(zhì)性特征，目前的修復(fù)包括以下幾個(gè)步驟。
[0005] 利用T4 DNA polymerase或者Klenow Fragment的5'_3'DNA聚合酶活性，在dNTP存 在條件下，將5'-凸出末端進(jìn)行補(bǔ)平。利用T4 DNA polymerase或者Klenow Fragment的3'-5 ' DNA外切核酸酶活性，不需要dNTP，將3 凸出的末端切平。這兩個(gè)活性合并稱為DNA平末 端化(blunting)。隨后利用T4polynucleotide kinase的正向反應(yīng)活性，在ATP存在條件下， 在DNA的5 末端添加磷酸基團(tuán)。以上過(guò)程習(xí)慣性稱為DNA末端修復(fù)。
[0006] 利用Klenow Fragment(exo-)的DNA聚合酶非模板依賴性DNA聚合酶活性，在DNA的 3 ' -末端以dATP偏愛(ài)性方式添加 dA，由于缺失了 3 ' -5 ' DNA外切核酸酶活性(exo_)，使得添加 的3 末端凸出的dA得以保存。
[0007] 目前的各種DNA文庫(kù)制備試劑盒中的DNA末端修復(fù)方案都是基于以上原理。通過(guò)尋 找一些讓不同酶都具有活性的共同反應(yīng)緩沖液，對(duì)其中一些步驟進(jìn)行合并，以簡(jiǎn)化操作步 驟，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并降低在不同反應(yīng)環(huán)境中切換所進(jìn)行的純化操作帶來(lái)的DNA損失，以提 高DNA文庫(kù)制備效率。
[0008] 但是，基于這些酶加工過(guò)程的DNA末端修復(fù)，由于用于DNA 3'-末端加 A與3'-5'DNA 外切核酸酶活性不能兼容，導(dǎo)致DNA平末端化、磷酸化和加 A必須分開(kāi)進(jìn)行。因此，目前都是 將DNA末端修復(fù)和DNA末端加 dA分為兩步進(jìn)行，中間還得純化一次DNA，整體需要的時(shí)間在1 個(gè)半小時(shí)左右。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明為了克服上述方法的缺陷，提供一種采用一步法進(jìn)行DNA末端修復(fù)/加 dA的 方法及應(yīng)用，所述DNA末端修復(fù)的方法只需40min左右，提高了 DNA制備的效率。
[001 0]為達(dá)到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0011]第一方面，本發(fā)明提供一種采用一步法進(jìn)行DNA末端修復(fù)/加 dA的方法，所述方法 采用T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶的混合酶系。
[0012] 本發(fā)明利用同樣具有dATP偏愛(ài)性DNA末端非模板依賴性加 Α活性的Taq DNA polymerase完成DNA末端的加 A; -方面，Taq DNA polymerase僅在高溫72°C才具有活性，而 此時(shí)T4 DNA polymerase，T4 polynucleotide kinase早已熱變性失活，另一方面，T4 DNA polymerase和T4 polynucleotide kinase均可在較低溫度20°C完成活性，此時(shí)Taq DNA polymerase幾乎沒(méi)有活性，不會(huì)干擾DNA平末端化過(guò)程，因此在合適的反應(yīng)條件中，以上過(guò) 程可以在一個(gè)反應(yīng)體系中完成。
[0013] 本發(fā)明尋找到T4 DNA polymerase，T4 polynucleotide kinase，Taq DNA polymerase三者同時(shí)具備活性的反應(yīng)條件，即緩沖液條件和反應(yīng)溫度控制，可以將末端修 復(fù)和加 dA在一步完成，并不是所有的緩沖液調(diào)節(jié)和反應(yīng)溫度都可達(dá)到本發(fā)明超快速一步化 DNA末端修復(fù)和加 dA的效果。
[0014] 優(yōu)選地，所述T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶的體積比為1: (0· 1-5) :(1-15)，例如可以是1:0.1:1、1:0.2: 2、1:0.3:2、1:0·4:1、1:0.5:3、1:0.5:4、1: 0.5 :5、1:0.5:8、1:0.8:5、1 :1:5、1:2:7、1:3 :4、1:4:10、1:4:12、1 :5:10、1:5:12或1:5:15， 優(yōu)選為 1:(0.3-3): (2-10)，進(jìn)一步優(yōu)選為 1:0.5:5。
[0015]第二方面，本發(fā)明提供一種采用一步法進(jìn)行DNA末端修復(fù)/加 dA的預(yù)混液，所述預(yù) 混液包括如第一方面所述的混合酶系、dNTPs、ATP、反應(yīng)緩沖液和去離子水。
[0016] 優(yōu)選地，所述dNTPs中的dATP和dCTP+dTTP+dGTP的濃度比為（1 -20): 2，例如可以是 1:2、2:2、3:2、5:2、6:2、7 :2、8:2、9:2、10:2、12:2、13 :2、15:2、16:2、18:2或20:2，優(yōu)選為（5-10) :2,進(jìn)一步優(yōu)選為7:2。
[0017] 本發(fā)明尋找到了dATP和dCTP+dTTP+dGTP之間的合適比例，滿足DNA polymerase需 要的dNTP濃度的同時(shí)，也使得Taq DNA polymerase能夠以dATP傾向性的完成DNA末端非模 板性加 dA。
[0018] 優(yōu)選地，所述ATP的濃度為0. l-5mM，例如可以是0. lmM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、 0.5mM、0.8mM、ImM、2mM、3mM、4mM 或 5mM，優(yōu)選為0.1 -3mM，進(jìn)一步優(yōu)選為0.2mM。
[0019] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCl，KC1，MgCl2和DTT。
[0020] 優(yōu)選地，所述 Tr i S-HC1 的濃度為 5-5 OmM，例如可以是 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、1 OmM、 1ImM、12mM、13mM、15mM、16mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、25mM、26mM、28mM、30mM、35mM、 381^、4〇111]\1、45111]\1、48111]\1或5〇111]\1，優(yōu)選為1〇-4〇111]\1，進(jìn)一步優(yōu)選為2〇111]\1。
[0021] 優(yōu)選地，所述 KC1 的濃度為 10-80mM，例如可以是 1 OmM、1 ImM、12mM、15mM、16mM、 18mM、20mM、21mM、22mM、23mM、25mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、35mM、40mM、45mM、 5〇1^、55111]\1、6〇111]\1、65111]\1、7〇111]\1、73111]\1、75111]\1、78111]\1或8〇111]\1，優(yōu)選為2〇-6〇111]\1，進(jìn)一步優(yōu)選為3〇111]\1。
[0022] 優(yōu)選地，所述MgCl2的濃度為0.5-8mM，例如可以是0.5mM、0.6mM、0.8mM、lmM、 1 · ImM、1 · 2mM、1 · 3mM、1 · 5mM、1 · 8mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM或8mM，優(yōu)選為 1-5mM，進(jìn)一步 優(yōu)選為1.2mM。
[0023] 優(yōu)選地，所述 DTT 的濃度為 1 -15mM，例如可以是 ImM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、 8mM、9mM、1 OmM、1 ImM、12mM、13mM、14mM 或 15mM，優(yōu)選為 3-1 OmM，進(jìn)一步優(yōu)選為 4mM。
[0024] 優(yōu)選地，所述預(yù)混液為1 〇yL，包含以下組分：
[0025] 緩沖液： Tris-Ηα 20 mM KCI 30 mM
[0026] MgCI2 1,2 mM DTT 4 mM ATP 0.2 mM dATP 0.7 mM dCTP 0.2 mM dTTP 0,2 mM
[0027] dGTP 0.2 mM T4 DNA聚合酶 1. U Taq DNA 聚合酶 0,5 U T4多核苷酸激酶 5 ?
[0028] 去離子水加至10yL。
[0029] 第三方面，本發(fā)明提供一種如第二方面所述的預(yù)混液的使用方法，所述方法包括 如下步驟：
[0030] (1)將待修復(fù)的DNA打斷，取打斷的DNA 2-10ng;
[0031] (2)將步驟(1)中打斷的DNA與預(yù)混液混勻，15-30 °C反應(yīng)后升溫再反應(yīng)。
[0032] 優(yōu)選地，步驟(2)所述打斷DNA與預(yù)混液的體積比為1:5,例如可以是1:5、1:4、1:3、 1:2或1:1，優(yōu)選為1:3,進(jìn)一步優(yōu)選為1: 1。
[0033] 優(yōu)選地，步驟（2)所述升溫前的溫度為16-25 °C，例如可以是16 °C、17 °C、18 °C、19 °C、20°C、21°C、22°C、23°C、24°C或25°C，優(yōu)選為20°C。
[0034] 優(yōu)選地，步驟(2)所述升溫前的反應(yīng)時(shí)間為5_30min，例如可以是5min、6min、7min、 8min、9min、lOmin、12min、15min、16min、18min、20min、22mi