一種花生種子特異啟動子ahssp1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種花生種子特異啟動子AHSSP1及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 花生是世界重要的油料作物，其籽仁中蛋白質(zhì)含量為24%~36%;含油量高達(dá) 38%~60%，是重要的食用蛋白源和食用植物油源。此外，花生中還富含植物固醇、白藜蘆 醇、維生素 E、維生素 C和葉酸等植物活性物質(zhì)，對促進(jìn)健康、預(yù)防疾病十分有益。隨著生物技 術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)對花生籽仁中蛋白質(zhì)、油脂及其它營養(yǎng)成分進(jìn)行遺傳改良或 以花生籽仁作為"生物反應(yīng)器"異源合成蛋白疫苗等已成為一種非常有效的手段。
[0003] 花生種子特異啟動子作為一類專一性啟動子，能指導(dǎo)外源基因在花生種子中特異 表達(dá)，它不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在種子中積累，增加在種子中的表達(dá)量，而且也避免 了植物營養(yǎng)的浪費。所以，利用花生種子特異性啟動子控制目的基因在種子中特異表達(dá)具 有重要的理論和實踐意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種花生種子特異啟動子AHSSP1及其應(yīng)用，本發(fā)明在花生中克隆到 一個951bp的啟動子片段AHSSP1，經(jīng)生物信息學(xué)分析、RT-PCR以及轉(zhuǎn)基因驗證，確定AHSSP1 是一個能驅(qū)動外源基因在種子中特異表達(dá)的啟動子。
[0005] 本發(fā)明具體采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種花生種子特異啟動子AHSSP1，其具有如SEQ ID No:l所示的核苷酸序列。
[0007] 進(jìn)一步的：所述花生種子特異啟動子AHSSP1含有RNA聚合酶結(jié)合位點TATA box、 CAAT box和RY元件。
[0008] 進(jìn)一步的：擴增所述花生種子特異啟動子AHSSP1的引物AHSSP1-F2和AHSSP1-R2序 列為：
[0009] AHSSP 卜F2:5，-AAGCTTGCAGAAATAGAAAGTGGGAACAAA-3，；
[0010] AHSSP1-R2:5 '-GGATCCGTGGTGGTTATGGAATGTGTATTGAAGA-3 '。
[0011] 進(jìn)一步的：擴增所述花生種子特異啟動子AHSSP1的PCR擴增體系為:ddH2〇 31yL， 含 Mg2+的 5XHF buffer 10yL;濃度為 2.5mM 的 dNTP 2yL;濃度均為 5μΜ 的 AHSSP 卜 F2 和 AHSSP1-R2各2yL; DMS0 0 · 6yL; Phus ion酶0 · 5yL;基因組模板2yL。
[0012]進(jìn)一步的：擴增所述花生種子特異啟動子AHSSP1的PCR反應(yīng)條件為：98°C預(yù)變性 30s ;98°C 變性 10s，58°C 退火 10s，72°C50s，30 個循環(huán)；72°C 后延伸 lOmin。
[0013] 本發(fā)明還提供了所述的花生種子特異啟動子AHSSP1在驅(qū)動外源基因在植物的種 子中特異表達(dá)中的作用。
[0014] 進(jìn)一步的:所述外源基因為⑶S基因。
[0015] 進(jìn)一步的:所述植物為擬南芥。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點和技術(shù)效果是:本發(fā)明首先提取花生葉片總DNA，用啟動子特異引物 AHSSP1-F2和AHSSP1-R2進(jìn)行PCR擴增，將擴增的片段膠回收后，連接到克隆載體pEASY-Blunt simple中。生物信息學(xué)分析，該啟動子含有重要的RNA聚合酶結(jié)合位點TATA box、 CAAT box，以及種子啟動子所特有的RY元件，初步證明AHSSP1是種子特異啟動子。
[0017] 經(jīng)RT-PCR對其驅(qū)動的下游基因 AHSSP1進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該基因在成熟種子表達(dá)，而 在成熟植株的根、莖和葉片中不表達(dá)。這進(jìn)一步表明AHSSP1是種子特異啟動子。用Hindi和 BamHI從pEASY-Blunt simple載體切下該片段，替換掉植物表達(dá)載體pBI 121中的35S。將構(gòu) 建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。利用"蘸花法"對擬南芥(Co 1 0生態(tài)型)進(jìn)行遺傳 轉(zhuǎn)化，對轉(zhuǎn)基因 T2代擬南芥萌發(fā)1-8天的幼苗進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析發(fā)現(xiàn)：剛萌發(fā)的幼 胚染色最深，未長出真葉、保持胚性的幼苗也有較深的染色，而在長出真葉的幼苗中沒有檢 測到藍(lán)色。這說明，AHSSP1能驅(qū)動GUS報告基因在植物種子中特異表達(dá)，足以證明它是一個 種子特異啟動子。
[0018] 所以本發(fā)明獲得了一個新的花生種子特異啟動子AHSSP1，其克隆鑒定將對花生籽 仁品質(zhì)改良或以花生籽仁作為"生物反應(yīng)器"異源合成藥物蛋白等具有重要的應(yīng)用價值。
[0019] 結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的【具體實施方式】后，本發(fā)明的其他特點和優(yōu)點將變得更加清 楚。
【附圖說明】
[0020] 圖1是RT-PCR檢測AHSSP1基因在花生根、莖、葉和成熟種子中的表達(dá)情況，Actin是 內(nèi)標(biāo)基因。
[0021] 圖2是AHSSP1啟動子的PCR擴增及植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。A:啟動子AHSSP1片段 示意圖；B:植物表達(dá)載體pBI121結(jié)構(gòu)示意圖；C:啟動子AHSSP1片段與植物表達(dá)載體pBI121 連接得到質(zhì)粒PBI121-AHSSP1 ;D:PCR獲得啟動子AHSSP1片段。M:分子量標(biāo)記Marker (Trans2K PlusII);⑶S:β-葡聚糖苷酶基因；NPTII:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；N0S-P:胭脂堿 合酶基因啟動子;N0S-T:胭脂堿合酶基因終止子;35S-P:煙草花葉病毒35S啟動子;LB:左邊 界;RB:右邊界。
[0022]圖3是AHSSP1啟動子序列及順式作用元件分析。
[0023]圖4是轉(zhuǎn)AHSSP1::⑶S擬南芥PCR檢測，其中1-10:隨機選取的10株卡那抗性的轉(zhuǎn)基 因擬南芥;Ρ質(zhì)粒對照;WT:野生型擬南芥Col 0;Μ:分子量標(biāo)記Marker(Trans2K PlusII)。
[0024]圖5是GUS組織化學(xué)染色，其中A:萌發(fā)第1天的種子，能染較深的藍(lán)色;B:種子萌發(fā) 第5天，保持胚性的根、莖和子葉均能染色;C:幼苗長至第8天，此時種子胚性完全喪失，不能 再被染成藍(lán)色。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0026] 實施例1
[0027] 本實施例具體包括以下試驗過程：
[0028] 1 · 1試驗材料
[0029]植物材料為市售的花生品種"花育33"和擬南芥(生態(tài)型ColO)。大腸桿菌DH5a感受 態(tài)、DNA分子量標(biāo)記、PCR mix等購自北京全式金生物有限公司；高保真酶Phusion購自New England Biolabs公司；X-Gluc購自北京索萊寶科技有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHI和 Hindlll購自Fermentas公司；T4 DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小提試 劑盒和膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；農(nóng)桿菌菌株GV3101以及超表達(dá)載 體PBI121為本申請人提供。
[0030] 1.2 AHSSP1所驅(qū)動基因內(nèi)源表達(dá)分析
[0031] 設(shè)計基因特異引物AHSSP1-F1和AHSSP1-R1 (如表1所示），提取花生栽培種"花育 3 3"根、莖、葉片和成熟種子的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用RT-PCR方法檢測其在根、莖、葉片和 種子中的表達(dá)情況，以花生基因 Actin作為內(nèi)參基因（表1)。
[0032]圖1實驗結(jié)果顯示:該基因只在種子中有很強的表達(dá)信號，在根、莖和葉片中均不 表達(dá)。這表明該基因在種子中特異表達(dá)。
[0033] 該啟動子DNA序列（SEQ IN N0:1)如下：
[0034]
[0035] 1.3花生幼嫩葉片DNA提取及AHSSP1啟動子片段的克隆
[0036]本發(fā)明用植物DNA提取試劑盒提取"花育33"幼嫩葉片基因組，以此為模板，使用高 保真酶Phusion，利用AHSSP1特異引物AHSSP1-F2和AH