、N111、C78和 C96。根據(jù)FGF2晶體結(jié)構(gòu)（1EV2)，這些殘基位于蛋白質(zhì)的表面上。生成三個(gè)經(jīng)改造形式的 FGF2并且測(cè)試與野生型蛋白質(zhì)相比較下增加的熱穩(wěn)定性：1)Q65(極性)與脂肪族疏水殘基 (1^、1、￥)和附11與小尺寸殘基(4、6)的組合;2)組合（1)加上096與更極性的殘基(5、1')，因?yàn)?對(duì)于FGF2中的半胱氨酸，F(xiàn)GF1具有蘇氨酸;和3)組合（1)加上C78和C96與更極性的殘基(S、 T)。
[0046]設(shè)計(jì)和產(chǎn)生多核苷酸在遺傳學(xué)家的范圍內(nèi)，所述多核苷酸編碼點(diǎn)突變或?qū)е卤磉_(dá) 與未經(jīng)改造的蛋白質(zhì)不同的氨基酸的突變。在這點(diǎn)上，經(jīng)典或"標(biāo)準(zhǔn)"氨基酸指由六十四個(gè) 三聯(lián)密碼子編碼的二十種天然存在的氨基酸。這些密碼子中除了三個(gè)外全部編碼"有義"氨 基酸，而三個(gè)"無(wú)義"密碼子表示停止或終止信號(hào)。這20種氨基酸可以分成具有中性電荷、正 電荷和負(fù)電荷的氨基酸：。
[0047] "中性"氨基酸在下文連同其各自的三字母和單字母編碼、極性和三聯(lián)體編碼DNA 密碼子一起顯示： 丙氨酸：（Ala，A)非極性，中性(GCT、GCC、GCA、GCG); 天冬酰胺：（Asn，N)極性，中性(AAT、AAC); 半胱氨酸：（Cys，C)非極性，中性(TGT、TGC); 谷氨酰胺：（Gln，Q)極性，中性(CAA、CAG); 甘氨酸：（Gly，G)非極性，中性(GGT、GGC、GGA、GGG); 異亮氨酸：（Ile，I)非極性，中性(ATT、ATC、ATA); 亮氨酸：（Leu，L)非極性，中性(TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG); 甲硫氨酸：（Met，M)非極性，中性(ATG); 苯丙氨酸：（Phe，F(xiàn))非極性，中性(TTT、TTC); 脯氨酸：（Prο，P)非極性，中性(CCT、CCC、CCA、CCG); 絲氨酸：（Ser，S)極性，中性(TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC); 蘇氨酸：（Thr，T)極性，中性(ACT、ACC、ACA、ACG); 色氨酸：（Trp，W)非極性，中性(TGG); 酪氨酸：（Tyr，Y)極性，中性(TAT、TAC); 纈氨酸：（Val，V)非極性，中性(GTT、GTC、GTA、GTG)jP 組氨酸：（Hi s，Η)極性，正（10%)中性(90%) (CAT、CAC)。
[0048]帶"正"電荷的氨基酸是： 精氨酸：（Arg，R )極性，正(CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG );和 賴氨酸：（Lys，K)極性，正(AAA、AAG)。
[0049]帶"負(fù)"電荷的氨基酸是： 天冬氨酸：（Asp，D)極性，負(fù)(GAT、GAC);和 谷氨酸：（Glu，E)極性，負(fù)(GAA、GAG)。
[0050]相應(yīng)地，編碼這些中性、帶正和負(fù)電荷的氨基酸的三聯(lián)體可以改造成如本文公開(kāi) 的FGF2編碼多核苷酸，以產(chǎn)生新型熱穩(wěn)定的FGF2突變體。
[0051 ] 因此，在上文公開(kāi)的三個(gè)舉例說(shuō)明突變組，即（1)Q65I + N111G、（2)Q65I + N111G + C96S和(3)Q65I + N111G + C78S + C96S的背景下，可以在更大的編碼多核苷酸中產(chǎn)生 合適三聯(lián)體密碼子，其實(shí)現(xiàn)所選氨基酸的所需置換。例如，在位置65處，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以通過(guò)在編碼序列中作出合適的核苷酸變化，容易地將谷氨酰胺(Q)密碼子(CAA或CAG)改 變?yōu)楫惲涟彼幔↖)密碼子(ATT、ATC或ΑΤΑ)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地作出上述突變 和氨基酸置換。然而，本技術(shù)并不僅限于FGF2氨基酸置換的這些具體組合?？梢栽贔GF2編碼 序列中實(shí)現(xiàn)任何其他點(diǎn)突變，以產(chǎn)生其他氨基酸置換以產(chǎn)生其他FGF2突變體。
[0052] 在這點(diǎn)上，含有突變的FGF2多核苷酸編碼序列的經(jīng)改造的質(zhì)粒可以容易地轉(zhuǎn)染到 人細(xì)胞內(nèi)并且在細(xì)胞中表達(dá)，所述細(xì)胞適合或不適合在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。參見(jiàn)例 如，通過(guò)引用并入本文的PCT/US2009/036975中描述的方法和材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，表 達(dá)FGF2的人細(xì)胞可以在收獲用于純化前在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。用于從細(xì)胞培養(yǎng)物中 純化蛋白質(zhì)的方法是眾所周知的，例如通過(guò)使用在其上裝載培養(yǎng)物的多個(gè)級(jí)分的適當(dāng)平衡 的DEAE柱且隨后洗脫。重組FGF2突變型蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可以例如通過(guò)SDS-PAGE考馬斯染 色和蛋白質(zhì)印跡容易地分析。如下文實(shí)施例中詳細(xì)描述的，與野生型蛋白質(zhì)和其他經(jīng)改造 的蛋白質(zhì)相比較，Q65I + N111G + C96S(QNCm)突變的組合出乎意料地增加蛋白質(zhì)的表達(dá) 水平。這個(gè)結(jié)果是出乎意料的，因?yàn)橥ㄟ^(guò)在模擬FGF1改造中引入Q65I + NlllG(QNm)加上現(xiàn) 有P58,或通過(guò)如大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)般用絲氨酸置換兩個(gè)半胱氨酸Q65I + N111G + C78S + C96S(QNCCm)，來(lái)自人細(xì)胞表達(dá)的真正FGF2的穩(wěn)定性未得到改善。
[0053] 為了測(cè)試重組表達(dá)的FGF2突變體的熱穩(wěn)定性，一種方法可能需要將大腸桿菌表達(dá) 的野生型FGF2和人細(xì)胞表達(dá)的FGF2突變體在無(wú)血清培養(yǎng)基中貯存于-80°C、37°C和37°C多 個(gè)時(shí)間段。然后，F(xiàn)GF2蛋白質(zhì)可以通過(guò)監(jiān)察其刺激3T3細(xì)胞增殖的能力就其穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè) 定。關(guān)于執(zhí)行3T3細(xì)胞增殖穩(wěn)定性測(cè)定的示例性方法與材料參見(jiàn)下文實(shí)施例。
[0054] 測(cè)定結(jié)果揭示Q65I + N111G + C96S FGF2突變體保留相同生物活性，不論它貯存 的溫度和時(shí)間段。相比之下，當(dāng)貯存于37°C2小時(shí)時(shí)，野生型FGF2喪失其一半活性，并且在37 °C24小時(shí)后，喪失其90%的活性。Q65I + N111G + C96S FGF2突變體在重復(fù)的基于細(xì)胞的測(cè) 定中具有熱穩(wěn)定性中的10倍改善。
[0055] 在一些實(shí)施方案中，本組合物包含具有氨基酸置換的全長(zhǎng)FGF2，與野生型蛋白質(zhì) 相比較，所述氨基酸置換使得其熱穩(wěn)定性增加。氨基酸置換可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的分子生 物學(xué)技術(shù)例如通過(guò)PCR介導(dǎo)的誘變引入蛋白質(zhì)內(nèi)。重組蛋白質(zhì)可以在多種細(xì)胞系統(tǒng)包括但 不限于細(xì)菌和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中表達(dá)，使用對(duì)于細(xì)胞類型適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體和培養(yǎng)條件。在這 些細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行純化和表征。
[0056] 在一些實(shí)施方案中，本組合物包含具有至少一個(gè)氨基酸置換的全長(zhǎng)FGF2。在一些 實(shí)施方案中，置換選自〇651^、〇651、〇65￥、價(jià)114、價(jià)116、0965和0961'。
[0057]在一些實(shí)施方案中，組合物包含編碼SEQ ID N0:2的變體的多肽或其片段的多核 苷酸，所述多肽或片段包含選自0651^、0651、065￥川11^川1116丄963和〇961'的至少一個(gè)氨 基酸置換。在一些實(shí)施方案中，組合物包含編碼與SEQ ID N0:2具有至少85%序列同一性的 多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或片段包含選自Q65L、Q65I、Q65V、N111A、N111G、C96S 和C96T的至少一個(gè)氨基酸置換。在一些實(shí)施方案中，編碼的多肽包含氨基酸置換Q65I、 N111G和C96S。在一些實(shí)施方案中，編碼的多肽包含SEQ ID N0:8。
[0058] 在一些實(shí)施方案中，本組合物包含表達(dá)載體，其包含編碼經(jīng)改造的FGF2蛋白質(zhì)的 多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該載體包含編碼SEQ ID N0:2的多肽變體或其片段的多核苷 酸，所述多肽變體或片段包含選自0651^、0651、065￥、附1^、附116、〇963和〇961'的至少一個(gè) 氨基酸置換。在一些實(shí)施方案中，該載體包含編碼與SEQ ID N0: 2具有至少85%序列同一性 的多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或片段包含選自Q65L、Q65I、Q65V、N111A、N111G、 C96S和C96T的至少一個(gè)氨基酸置換。在一些實(shí)施方案中，由該載體表達(dá)的多肽包含氨基酸 置換Q65I、N111G和C96S。在一些實(shí)施方案中，編碼的多肽包含SEQ ID N0:8。
[0059] 在一些實(shí)施方案中，該組合物包含SEQ ID NO:2的多肽變體或其片段，其包含選自 〇651^、〇651、〇65￥、附114、附116、0963和0961'的至少一個(gè)氨基酸置換。在一些實(shí)施方案中，該 組合物包含與SEQ ID N0:2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段，其包含選自Q65L、 〇651、〇65￥、附114、附116、0963和0961'的至少一個(gè)氨基酸置換。在一些實(shí)施方案中，該多肽 包含氨基酸置換Q65I、N111G和C96S。在一些實(shí)施方案中，該多肽包含SEQ ID N0:8。
[0060] 方法 本公開(kāi)內(nèi)容提供在ES細(xì)胞的培養(yǎng)中使用經(jīng)改造的FGF2蛋白質(zhì)的方法，所述經(jīng)改造的 FGF2蛋白質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)相比較具有增加的熱穩(wěn)定性。Q65I + N111G + C96S FGF2突變 體的優(yōu)良的熱穩(wěn)定性和生物活性意味著與暴露于野生型FGF2的ES細(xì)胞相比較延長(zhǎng)了處于 未分化狀態(tài)的人胚胎干細(xì)胞的多能性時(shí)期。
[0061] 本文公開(kāi)的結(jié)果顯示，與補(bǔ)充有651 + N111G + C96S置換的FGF2的不依賴于飼養(yǎng) 細(xì)胞的培養(yǎng)物相比較，補(bǔ)充有野生型FGF2的培養(yǎng)物顯示顯著更多的分化。因此，具有Q65I + N111G + C96S FGF2的干細(xì)胞培養(yǎng)物需要比補(bǔ)充有野生型蛋白質(zhì)的培養(yǎng)物更少的FGF2補(bǔ) 充，其提供成本節(jié)省。此外，置換的FGF2的使用通過(guò)減少培養(yǎng)物的人為處理和操作的需要從 而減少細(xì)胞培養(yǎng)物的非故意污染的潛力。就在培養(yǎng)過(guò)程期間需要更少的FGF2蛋白質(zhì)與更少 處理和人為干預(yù)(其意味著勞力、成本和時(shí)間中的減少)而言，舉例說(shuō)明性Q65I + N111G + C96S FGF2突變體的商業(yè)價(jià)值是顯而易見(jiàn)的。
[0062]相應(yīng)地，本發(fā)明技術(shù)包括在細(xì)胞培養(yǎng)中使用熱穩(wěn)定的FGF2突變體例如Q65I + N111G + C96S FGF2的方法，和用于維持人胚胎干細(xì)胞處于非分化狀態(tài)的方法。在一些實(shí)施 方案中，該方法包括在包含有效量的權(quán)利要求6的多肽的不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)胚胎干細(xì)胞，其中所述有效量包含維持該細(xì)胞具有未分化形態(tài)至少5傳代所需的量。在一 些實(shí)施方案中，不依賴于飼