賦予植物黃萎病抗性的lrk1基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了一個(gè)賦予植物黃萎病抗性的LRK1基因及其應(yīng)用，涉及植物基因克隆 以及功能分析，屬于植物基因工程領(lǐng)域。用于通過(guò)植物基因工程技術(shù)改善植物抗病性和其 他有益生產(chǎn)性狀。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，生產(chǎn)上黃萎病危害十分嚴(yán)重，是棉花、番茄、辣椒、茄子等植物的主要真菌病 害，造成減產(chǎn)甚至絕收，尚無(wú)有效的防治措施。黃萎病的病原主要為大麗輪枝菌 (Verticillium dahliae)，以微菌核(microsclerotia)形式長(zhǎng)期存在于土壤中。黃萎病菌 在寄主植物上會(huì)表現(xiàn)出致病性差異，在與寄主相互作用、協(xié)同進(jìn)化及生態(tài)環(huán)境差異的影響 下，常產(chǎn)生生理分化，出現(xiàn)新的致病類型。張?zhí)煺娴扔肦Aro指紋圖譜聚類分析將我國(guó)棉花黃 萎病菌株劃分為8類，但是同一類中可能同時(shí)含有強(qiáng)中弱致病菌，說(shuō)明黃萎病菌致病機(jī)制十 分復(fù)雜(張?zhí)煺妫?000)。另外，由轉(zhuǎn)座子和DNA水平轉(zhuǎn)移等引起的黃萎病菌遺傳變異也限制 了棉花抗黃萎病育種(Amyotte SG，et al.，2012;de Jonge，et al.，2012)。因此，克隆抗性 基因、解析抗病機(jī)制對(duì)棉花抗黃萎病育種意義重大而迫切。
[0003] 然而，目前對(duì)黃萎病菌具有抗性的基因較少，尤其對(duì)棉花黃萎病具有穩(wěn)定廣譜高 抗的基因未見報(bào)道。Fradin等(2011)將番茄中Vel轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了對(duì)黃萎病菌的抗性， 而該基因轉(zhuǎn)化煙草和棉花后，不具有黃萎病抗性，表明該基因在植物上的應(yīng)用具有物種特 異性(劉琳琳等，棉花與番茄抗棉花黃萎病不依賴于Vel，中國(guó)科學(xué):生命科學(xué)，2014(44)卷 第8期：803-814)。從抗黃萎病海島棉品種H7124中克隆了與番茄Vel基因 （Fradin et al.， 2009)和棉花GbVe基因 （Zhang et al .,2011)部分同源的Gbvel基因，該基因也具有典型的 植物抗病蛋白結(jié)構(gòu)域，利用VIGS沉默Gbve 1基因可使海島棉H7124對(duì)黃萎病的抗性喪失;并 且，Gbvel基因轉(zhuǎn)化擬南芥和陸地棉的結(jié)果都表明Gbvel基因?qū)?qiáng)致病力的落葉型和非落葉 型黃萎病菌都具有抗性(Zhang et al.，2012a)，但是并未獲得高抗黃萎病品種。除了Ve基 因外，一些下游防衛(wèi)相關(guān)基因也用于抗黃萎病防治研究。過(guò)量表達(dá)AtNPRl基因的轉(zhuǎn)基因棉 花對(duì)非落葉型黃萎病具有抗性，但是對(duì)落葉型黃萎病不具有抗性(Parkhi et al.2010)。另 外，水稻黃單胞菌harpin蛋白、幾丁質(zhì)酶基因、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移酶基因、天麻抗真菌蛋白、抗菌肽、 防御素（Q _Defensins)(Miao et al.，2010;Munis，2010;Ni M et al.，2013)也對(duì)黃萎病表 現(xiàn)出一定的抗性，但是由于防衛(wèi)基因的過(guò)量表達(dá)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育帶來(lái)一些不利影響、以及 抗性效果未達(dá)到預(yù)期目標(biāo)等，從而限制了這些基因在生產(chǎn)上的應(yīng)用。
[0004] 本研究通過(guò)陸地棉高抗黃萎病品種奧3503的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)高抗黃萎 病基因 LRK1，該基因與雷蒙德氏棉幾丁質(zhì)類受體激酶基因 l(Chitin elicitor receptor kinasel-like，登錄號(hào)XM_012617234)相似度99%，以該基因的序列為模板設(shè)計(jì)引物將LRK1 基因克隆，并將該基因轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對(duì)落葉型以及非落葉型菌系 均具有較高的抗性。棉花黃萎病抗性基因 LRK1的分離可以進(jìn)一步豐富抗性基因資源，對(duì)其 功能研究為該類基因的進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。 三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 技術(shù)問題
[0006] 本發(fā)明的目的是:提供了一個(gè)賦予植物黃萎病抗性LRK1基因及其應(yīng)用，該基因編 碼一個(gè)表面受體蛋白，受黃萎病病原菌誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著增加。該基因表達(dá)可以顯著提高 受體植物對(duì)落葉黃萎病病原菌V991以及非落葉型黃萎病菌BP2的抗性。可以利用本發(fā)明基 因構(gòu)建成各種植物表達(dá)載體，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種以提高作物抗病性狀。
[0007] 技術(shù)方案
[0008]本發(fā)明涉及一個(gè)賦予植物黃萎病抗性的LRK1基因，其序列為SEQ ID N0.1。該基因 來(lái)源于陸地棉品種奧35031RK1基因完整編碼框長(zhǎng)度為1860個(gè)堿基，編碼蛋白含619個(gè)氨基 酸，分子量為67.3KD，等電點(diǎn)為5.LLRK1的功能研究揭示其表達(dá)調(diào)控機(jī)理以及作用機(jī)制，可 應(yīng)用于植物抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。
[0009] 本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體和宿主菌以及擴(kuò)增該基因的任一片 段的引物。
[0010] 所述LRK1基因可在賦予植物黃萎病抗性中的應(yīng)用。尤其是在賦予擬南芥植物黃萎 病抗性中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明賦予植物黃萎病抗性的LRK1基因，該基因受棉花黃萎病強(qiáng)致病力菌株V991 的誘導(dǎo)后表達(dá)量增加，將LRK1構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCambia2301載體(上海北諾生物科技有 限公司）上轉(zhuǎn)化擬南芥，結(jié)果轉(zhuǎn)基因植株對(duì)棉花黃萎病強(qiáng)致病力落葉型菌株V991以及非落 葉型菌株BP2均具有較高抗性?？梢岳帽景l(fā)明的基因構(gòu)建成各種植物表達(dá)載體，應(yīng)用于農(nóng) 業(yè)生物技術(shù)育種以提高相關(guān)寄主植物對(duì)黃萎病的抗病性或用在棉花黃萎病抗性改良中。 [00 12]其應(yīng)用包括：
[0013] 1)LRK1基因的克隆以及植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0014]以陸地棉品種奧3503的cDNA為模板，用引物
[0015] PI:5 '-TGCTCTAGAATGCTGAAATTAATCTCGATTC-3 '，
[0016] P2:5 '-CGCGGATCCTTATCTTCCGGACATAAGGT-3 '
[0017] 擴(kuò)增得到1860bp片段，將該片段命名為L(zhǎng)RK1，PCR產(chǎn)物純化后用Xbal/BamM酶切， 連接到pCambia2301載體，測(cè)序后成功構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCambia2301 :LRK1;
[0018] 2)轉(zhuǎn)基因植株的獲得
[0019] 將步驟1)中構(gòu)建好的Pcambia2301: LRK1質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，用蘸 花法轉(zhuǎn)化擬南芥，當(dāng)代的擬南芥植株為T0代，收獲的種子為T1代；
[0020] T1代種子在含25mg/mL卡那抗生素的1/2MS培養(yǎng)基上篩選，獲得候選的陽(yáng)性T1植 株，分別在DNA和RNA水平上檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)入以及是否成功表達(dá)；
[0021] 用引物
[0022] P3:5 '-CTGGGAATGTTTTTGGAAG-3 '
[0023] P4:5 '-ACTCGGTCGTAGCTGAGGA-3 '
[0024]擴(kuò)增獲得920bp大小片段的T1植株則為成功轉(zhuǎn)化LRK1的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，收獲的 種子為T2代。T2代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株在含25mg/mL卡那抗生素的1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且具有 黃萎病抗性。
[0025] 有益效果
[0026] 本研究通過(guò)陸地棉高抗黃萎病品種奧3503接種黃萎菌后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) 一個(gè)基因受黃萎菌誘導(dǎo)表達(dá)，該基因與雷蒙德氏棉幾丁質(zhì)類受體激酶基因 l(Chitin elicitor receptor kinasel-like，登錄號(hào)XM_012617234)相似度99%，以該基因的序列為 模板設(shè)計(jì)引物將該基因克隆，命名為L(zhǎng)RK1，并將該基因轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥植 株對(duì)落葉型以及非落葉型菌系均具有較高的抗性。棉花黃萎病抗性基因 LRK1的分離可以進(jìn) 一步豐富抗性基因資源，對(duì)其功能研究為該類基因的進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。具有如下的優(yōu) 點(diǎn)和效果：
[0027 ] 1.本發(fā)明獲得了 一個(gè)全新的賦予植物黃萎病抗性的LRK1基因。本發(fā)明獲得的LRK1 基因來(lái)源于陸地棉品種奧3503,該基因受棉花黃萎病病原菌誘導(dǎo)后表達(dá)量明顯上升。將 LRK1與構(gòu)建植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，結(jié)果該基因在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)后對(duì)落葉型強(qiáng)致病 力黃萎病菌V991和非落葉型強(qiáng)致病力黃萎病菌BP2均具有較強(qiáng)的抗性，發(fā)病率分別為 9.9%、8.2%，而對(duì)照野生型發(fā)病率分別為61.2%，56.3% IRKl的分離可以進(jìn)一步豐富抗 性基因資源，其功能研究為該類基因的進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。
[0028] 2.本發(fā)明有助于更好地了解抗病基因的作用機(jī)制。LRK1的克隆為進(jìn)一步了解病原 菌與抗病基因互作，抗病信號(hào)傳導(dǎo)通路奠定基礎(chǔ)?？梢岳迷摶蜣D(zhuǎn)基因植株進(jìn)行進(jìn)一步 分析LRK1是怎樣傳遞抗性信號(hào)以及與了哪些信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，從而獲得抗性信號(hào)傳導(dǎo)通路。 LRK1的分離以及功能鑒定為研究抗病基因的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[0029] 3.本發(fā)明應(yīng)用于黃萎病抗性育種。LRK 1抗性效果良好，對(duì)測(cè)試的落葉型黃萎病菌 系V991和非落葉型黃萎病菌系BP2,發(fā)病率均低于10%，顯著低于對(duì)照野生型大于50%的發(fā) 病率，大幅提高了對(duì)黃萎病的抗性，在育種中有較大的應(yīng)用價(jià)值。 四、
【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1落葉型黃萎病菌系V991和非落葉型菌系BP2處理陸地棉品種奧3503后LRK1的 表達(dá)。
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