花生AhPLDα3蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物基因工程技術(shù)，具體地說(shuō)是花生AhPLDa3 蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 花生是我國(guó)重要的油料作物，年種植面積500萬(wàn)hm2左右，總產(chǎn)居世界首位，花生油 年產(chǎn)量占國(guó)產(chǎn)植物油的23% (廖伯壽等，2008)。目前國(guó)內(nèi)食用油過(guò)度依賴(lài)進(jìn)口，油脂供給安 全問(wèn)題凸顯，而花生在保障我國(guó)食用油供給安全、穩(wěn)定國(guó)內(nèi)油源方面，具有較大的潛力和優(yōu) 勢(shì)。但是，干旱卻成為花生生產(chǎn)水平進(jìn)一步提高、種植面積擴(kuò)大的嚴(yán)重障礙。我國(guó)花生集中 種植在干旱半干旱內(nèi)陸及丘陵地區(qū)，70 %以上受干旱威脅，每年因干旱減廣達(dá)30 %-50 % ; 并導(dǎo)致花生品質(zhì)劣變，油脂含量和品質(zhì)下降，黃曲霉毒素污染加重（姜慧芳和任小平， 2004)，給消費(fèi)者的健康帶來(lái)巨大威脅。所以，采取有效措施提高花生抗旱性勢(shì)在必行。近年 來(lái)，轉(zhuǎn)基因育種、分子育種等基因工程技術(shù)已成為提高作物抗旱性的重要手段，利用在干旱 脅迫應(yīng)答中起重要作用的基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化是獲得耐旱新品種和新種質(zhì)的重要途徑。因 此，發(fā)掘重要的抗旱基因資源，將為花生的耐旱遺傳改良奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[0003] 磷脂酶D(PLD)是發(fā)生在膜上的一類(lèi)重要信號(hào)因子，對(duì)植物適應(yīng)多種逆境脅迫(干 旱、低溫、高滲、病害等)的保護(hù)機(jī)制有重要作用，主要通過(guò)影響膜質(zhì)降解，改變膜質(zhì)成分，特 異性水解膜磷脂產(chǎn)生胞內(nèi)第二信使磷脂酸(PA)，以及與功能蛋白Ga等直接偶聯(lián)互作，來(lái)影 響細(xì)胞調(diào)節(jié)過(guò)程和參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而響應(yīng)逆境脅迫。在干旱脅迫膜脂信號(hào)傳導(dǎo)通路上， PLD處于中心地位(Mei jer和Munnik，2003)，能對(duì)水分虧缺迅速發(fā)生反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)干旱 的應(yīng)答(Chapman，1998)。植物PLD基因?qū)儆诙嗷蚣易?，其中PLDa最普遍。目前，擬南芥、水 稻、大豆等植物中均發(fā)現(xiàn)了3個(gè)以上不同類(lèi)型的PLDa基因（Shen等，2011)。不同的PLDa在特 定的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中執(zhí)行獨(dú)特的功能，作用機(jī)制各異，彼此無(wú)法取代（Li等，2009)。 Hong等(2010a)發(fā)現(xiàn)擬南芥PLDa 1和PLDa3均能提高植物對(duì)滲透脅迫的反應(yīng)能力，但PLDa 1是 通過(guò)調(diào)節(jié)ΑΒΑ促進(jìn)氣孔關(guān)閉以減少水分散失，而PLDa3則主要是通過(guò)促進(jìn)根系生長(zhǎng)以獲取更 多的水分來(lái)抵御滲透脅迫的威脅。美國(guó)Kansas州立大學(xué)的王學(xué)敏研究組圍繞PLDa做了許多 開(kāi)創(chuàng)性的研究，發(fā)現(xiàn)擬南芥PLDa的活性變化與植物水分虧缺狀態(tài)、葉片細(xì)胞膜水解及氣孔 運(yùn)動(dòng)是一致的(Wang，2000 )，PLDa及其產(chǎn)物PA在保衛(wèi)細(xì)胞ΑΒΑ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用(Wang， 2002)，可通過(guò)多種途徑與其他信號(hào)通路"交叉對(duì)話"，響應(yīng)干旱信號(hào)。Zhang等（2004)和 Mishra等(2006)發(fā)現(xiàn)ABI1和Ga分別以PLDal為分支參與調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)。Sang等（2001)發(fā)現(xiàn) PLDa基因抑制突變體的抗旱性比野生型顯著降低，而離體葉片失水速率明顯提高，指出PLD a被抑制后，氣孔對(duì)ΑΒΑ的敏感性降低，所以蒸騰失水速率增加，抗旱性下降。在蓖麻上，Hong 等（2008)將蓖麻PLDal在煙草中過(guò)量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株的水分蒸騰損失降低；干旱脅迫前 期，PLDal活性提高可促進(jìn)氣孔迅速關(guān)閉，減少水分散失;持續(xù)干旱傷害加重，PLDal促進(jìn)質(zhì) 膜水解，膜離子滲漏率和膜脂過(guò)氧化程度均大幅提高。在番茄和苜蓿上，Munnik等(2000)也 發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似現(xiàn)象。在豇豆中，El Maarouf等（1999)發(fā)現(xiàn)干旱脅迫后PLD酶在干旱敏感品種中 的增加量高于耐旱品種，促進(jìn)氣孔關(guān)閉減緩了植物受害程度。大量研究表明，在非生物脅迫 中，PLDa家族蛋白對(duì)植物響應(yīng)脅迫、自我保護(hù)的生物學(xué)過(guò)程起到了潛在的調(diào)節(jié)作用，但是目 前尚未見(jiàn)PLDa基因在花生中克隆和功能研究的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種花生AhPLDa3蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
[0005] 一種花生AhPLDa3蛋白編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006] 一種插入了SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的載體。
[0007] 如上述花生AhPLDa3蛋白編碼基因表達(dá)的AhPLDa3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 由上述花生AhPLDa3蛋白編碼基因在克隆過(guò)程中所用的引物名稱(chēng)與核苷酸序列如 下：
[0009] ahPLD3F:5'-GTGTCCGATCACCCTCATCAAC-3'，
[0010] ahPLD3R:5'-TCTAGGCTTTTAGTTCTTAAGCCCA-3'。
[0011]上述花生AhPLDa3蛋白編碼基因或上述載體在提高植物耐旱性中的應(yīng)用。所述的 植物為雙子葉植物或單子葉植物。
[0012] 本發(fā)明從花生中克隆了一個(gè)在干旱脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的基 因 AhPLDa3,其核苷酸序列為SEQ ID N0.1。該基因 mRNA表達(dá)分析表明其在干旱、ΑΒΑ和高鹽 脅迫處理后表達(dá)量均有明顯增加，并且維持在較高水平。該基因在花生或其他植物如擬南 芥中過(guò)量表達(dá)可明顯增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性。在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的葉片相對(duì)含 水量和脯氨酸含量顯著高于野生型植株，細(xì)胞質(zhì)離子外滲率和葉片丙二醛含量比野生型顯 著降低。本發(fā)明公開(kāi)了利用該基因進(jìn)行植物抗旱性改良的基因工程方法。該方法對(duì)轉(zhuǎn)基因 育種培育耐旱植物品種特別是花生品種具有一定的作用。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)χ?物耐旱性分子機(jī)理研究，以及提高植物耐旱性和相關(guān)性狀的改良具有重要的理論意義和潛 在的應(yīng)用價(jià)值，為分子育種提高作物抗旱性提供了新的基因資源。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為AhPLDa3基因在PEG-6000、ABA、NaCl和低溫處理下的表達(dá)模式分析顯示圖；
[0014] 圖2為PBarF3-AhPLDa3植物過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建示意圖；
[0015]圖3為AhPLDa3基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系轉(zhuǎn)錄水平分子鑒定示意圖；
[0016]圖4為轉(zhuǎn)AhPLDa3基因擬南芥生理指標(biāo)差異比較示意圖；
[0017] 其中，A:葉片相對(duì)含水量;B:葉片離子相對(duì)電導(dǎo)率;C:葉片脯氨酸含量;D:葉片丙 二醛含量。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0019] 下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。
[0020] 下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0021] 農(nóng)桿菌GV3101菌株和植物過(guò)表達(dá)載體pBarF3由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究 所花生研究室保存。
[0022] 哥倫比亞生態(tài)型擬南芥（Col-0)種子購(gòu)自Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC)，以下簡(jiǎn)稱(chēng)為野生型擬南芥。
[0023]實(shí)施例中的花生(Arachis hypogaea L.)品種冀花4號(hào)由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油 作物研究所花生研究室提供。
[0024] 實(shí)施例1:花生AhPLDa3基因 cDNA的克隆與鑒定
[0025]本發(fā)明以花生抗旱品種冀花4號(hào)為材料，篩選已經(jīng)構(gòu)建的花生幼苗水分脅迫24h誘 導(dǎo)表達(dá)的cDNA文庫(kù)，獲得抗旱相關(guān)的EST序列。經(jīng)大規(guī)模EST測(cè)序和序列拼接后，將得到的 Cluster和Contig與NCBI、SWISSPR0T等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模比對(duì)，獲得了基因功能注釋。選擇 在根、葉片中出現(xiàn)頻數(shù)較高的序列，依據(jù)EST同源比對(duì)和基本功能注釋信息，初步篩選出13 個(gè)克隆。利用M13引物對(duì)全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)質(zhì)粒重新測(cè)序，核酸序列經(jīng)0RF finder分析和全長(zhǎng)同 源基因比較，結(jié)果表明其中10個(gè)克隆包含完整的預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框(0RF)，在0RF 和端 均有同框架的終止密碼子、P〇lyA加尾信號(hào)及polyA尾。這些基因推測(cè)的氨基酸序列保守結(jié) 構(gòu)域分析表明，其中1個(gè)基因包含PLD蛋白家族的標(biāo)志序列，即2個(gè)HXKXXXXD基序--HKD1和 HKD2，它們是PLD催化水解的活性部位，還含有1個(gè)C2結(jié)構(gòu)域，它是與Ca2+結(jié)合的折疊域。該基 因片段的cDNA全長(zhǎng)2717bp，編碼區(qū)長(zhǎng)度為2439bp，根據(jù)已知序列分段擴(kuò)增該基因的基因組 全長(zhǎng)序列長(zhǎng)度為3031bp，編碼區(qū)內(nèi)含有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，外顯子長(zhǎng)度分別為42bp、 1931bp和466bp。該基因編碼812個(gè)氨基酸，序列同源性分析及進(jìn)化分析表明，它與蓖麻PLDa 和擬南芥PLDa3的進(jìn)化關(guān)系較近，但氨基酸序列一致性?xún)H為48%，位于一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分 支，表明該蛋白是一個(gè)新的PLDa家族成員，命名為AhPLDa3,該蛋白的氨基酸序列為序列表 SEQ ID N0.2,序列表中SEQ ID NO. 1為其核苷酸序列。
[0026] 實(shí)施例2:花生AhPLDa3基因在逆境脅迫下的表達(dá)模式