一種通過下調(diào)PAB4和PAB8提高植物對(duì)NaCl耐受性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種通過下調(diào)PAB4和PAB8提高植物對(duì)NaCl耐受性 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹽脅迫是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要因素之一。鹽脅迫主要是通過NaCl作為脅迫來對(duì) 植物造成損傷。土壤中高濃度的鈉離子會(huì)直接影響植物的蛋白質(zhì)合成、光合作用以及能量 代謝等等，進(jìn)而導(dǎo)致植物發(fā)芽率降低、發(fā)育遲緩、蛋白合成減少以及新陳代謝減緩等等，最 終嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量。截止到目前為止，全球鹽漬地的總面積約為9.5438億hm 2,而其中 我國占到了9913萬hm2,并且全球及我國鹽漬的面積每年都在不斷增加。
[0003] 在我國鹽漬地不斷增加的嚴(yán)峻形勢(shì)下，快速且有效改善和利用鹽漬地資源以及提 高鹽漬化土地上的作物產(chǎn)量具有極其重大的現(xiàn)實(shí)意義。目前為止，改善和利用鹽漬地的方 式主要有兩種：一是通過合理灌溉、淡水洗鹽等土地改良工程措施;但是，這些措施耗資巨 大且有很強(qiáng)的副作用，進(jìn)而實(shí)施難度較大且很難維持。另一有效利用鹽漬化土地的方法是 培育出高效耐鹽新品種，這將成為今后農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向。
[0004]植物的耐鹽性是由多基因數(shù)量性狀控制，并受環(huán)境影響的復(fù)雜性狀;因此，傳統(tǒng)的 育種方法在提高作物耐鹽性的效果上往往不是特別理想。隨著大量耐鹽基因的鑒定以及科 學(xué)家們對(duì)植物耐鹽分子機(jī)制研究的不斷深入，通過基因工程等手段提高作物的耐鹽性受到 極大重視?；蚬こ碳夹g(shù)手段的優(yōu)勢(shì)在于可以精確、穩(wěn)定和高效地改變基因表達(dá)，進(jìn)而可以 有效提高植物耐鹽性，極大地加快了育種速度，成為培育高效耐鹽新品種的重要途徑。而鑒 定出更多的耐鹽基因及深入研究植物耐鹽分子機(jī)制是培育高效耐鹽新品種的首要任務(wù)。
[0005] 幾乎所有真核生物的mRNA 3'端都存在Poly(A)尾巴，Poly(A)影響著mRNA幾乎所 有的代謝活動(dòng)，例如轉(zhuǎn)運(yùn)、降解和翻譯。Poly(A)結(jié)合蛋白[Poly(A)-binding protein, ΡΑΒΡ/ΡΑΒ ]是RNA結(jié)合蛋白超家族中一類高度保守的蛋白亞族，廣泛存在于酵母、線蟲和擬 南芥等真核生物不同類型的細(xì)胞中。PABP/PAB蛋白是重要的翻譯起始因子之一，它能與 mRNA末端poly (A)尾巴相結(jié)合，控制poly (A)的長(zhǎng)度，參與mRNA的翻譯、降解以及合成等重要 過程。
[0006] 酵母和動(dòng)物中對(duì)PABP基因的研究較為深入，而高等植物有關(guān)PABP基因的研究較 少。在酵母細(xì)胞中，PABP基因的缺失突變體是致死型的，說明該基因在對(duì)酵母細(xì)胞極其重 要。擬南芥PABP5基因是花藥特異性表達(dá)的，它的缺失可能會(huì)引起植物的敗育。擬南芥中 PAB4基因的基因號(hào)為At2g23350，PAB8基因的基因號(hào)為Atlg49760;另外，擬南芥中PAB2， PAB4和PAB8這三個(gè)基因被報(bào)道參與調(diào)控病毒的復(fù)制。
[0007] 隨著植物耐鹽分子機(jī)制研究的深入及應(yīng)用的拓展，如何利用已發(fā)現(xiàn)的耐鹽基因改 變植物對(duì)NaCl耐受性，如何培育高效耐鹽新品種來提高鹽堿化土地作物的單位產(chǎn)量成為研 究前沿。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種通過下調(diào)PAB4和PAB8提高植物對(duì)NaCl耐受性的方法。
[0009] 本發(fā)明所提供了如下A-C中任一的應(yīng)用：
[0010] A.蛋白質(zhì)1和蛋白質(zhì)2作為靶標(biāo)在如下任一中的應(yīng)用：
[0011] al)提尚植物的耐鹽性；
[0012] a2)選育耐鹽性提尚的植物品種；
[0013]所述蛋白質(zhì)1為PAB4蛋白；所述蛋白質(zhì)2為PAB8蛋白。
[0014] 在所述應(yīng)用中，所述"蛋白質(zhì)1和蛋白質(zhì)2作為靶標(biāo)"具體可為：以所述蛋白質(zhì)1和所 述蛋白質(zhì)2作為靶標(biāo)，下調(diào)所述蛋白質(zhì)1和所述蛋白質(zhì)2的表達(dá)。
[0015] B.能夠抑制植物中蛋白質(zhì)1和蛋白質(zhì)2表達(dá)和/或活性的物質(zhì)在如下任一中的應(yīng) 用：
[0016] al)提尚植物的耐鹽性；
[0017] a2)選育耐鹽性提尚的植物品種；
[0018] 所述蛋白質(zhì)1為PAB4蛋白；所述蛋白質(zhì)2為PAB8蛋白。
[0019] C.能夠抑制植物中蛋白質(zhì)1的編碼基因和蛋白質(zhì)2的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在如下 任一中的應(yīng)用：
[0020] al)提尚植物的耐鹽性；
[0021] a2)選育耐鹽性提尚的植物品種；
[0022] 所述蛋白質(zhì)1為PAB4蛋白；所述蛋白質(zhì)2為PAB8蛋白。
[0023] 更進(jìn)一步，所述蛋白質(zhì)1(PAB4蛋白）為由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì);所述蛋白質(zhì)2 (PAB8蛋白）為由序列表中序列6所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
[0024] 在本發(fā)明中，以上所有a2)中的所述選育耐鹽性提高的植物品種的方法，具體可包 括將所述蛋白質(zhì)KPAB4蛋白）和所述蛋白質(zhì)2(PAB8蛋白）表達(dá)量均較低的植株作為親本進(jìn) 行雜交的步驟。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種培育耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0026] 本發(fā)明所提供的培育耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟:在 受體植物中對(duì)蛋白質(zhì)1的編碼基因和蛋白質(zhì)2的編碼基因均進(jìn)行抑制表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植 物;所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比耐鹽性增強(qiáng)；
[0027] 所述蛋白質(zhì)1為PAB4蛋白；所述蛋白質(zhì)2為PAB8蛋白。
[0028] 更進(jìn)一步，所述蛋白質(zhì)1(PAB4蛋白）為由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì);所述蛋白質(zhì)2 (PAB8蛋白）為由序列表中序列6所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
[0029] 其中，所述"在受體植物中對(duì)蛋白質(zhì)1的編碼基因和蛋白質(zhì)2的編碼基因均進(jìn)行抑 制表達(dá)"可為任何能夠抑制所述受體植物中所述蛋白質(zhì)1的編碼基因和所述蛋白質(zhì)2的編碼 基因表達(dá)的方法。在本發(fā)明中，是從擬南芥生物研究中心[Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，http: //www. arabidopsis · org/]獲得的PAB4和PAB8基因雙敲除 突變體，該雙突變體對(duì)NaCl耐受性增強(qiáng)。當(dāng)然，也可以通過基因工程手段(RNAi技術(shù)）獲得 PAB4和PAB8低表達(dá)、對(duì)NaCl耐受性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。
[0030] 在上述應(yīng)用或方法中，所述蛋白質(zhì)1的編碼基因（即PAB4基因）是如下1)至5)中任 一所述的DNA分子：
[0031] 1)編碼序列為序列表中序列2自5'末端第157至2145位核苷酸所示的DNA分子；
[0032] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0033] 3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0034] 4)在嚴(yán)格條件下與1)-3)任一所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列3所示 的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0035] 5)與1)-4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列3所示 的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0036] 在上述應(yīng)用或方法中，所述蛋白質(zhì)2的編碼基因（即PAB8基因）是如下6)至10)中任 一所述的DNA分子：
[0037] 6)編碼序列為序列表中序列5自5'末端第261至2276位核苷酸所示的DNA分子；
[0038] 7)序列表中序列5所示的DNA分子；
[0039] 8)序列表中序列4所示的DNA分子；
[0040] 9)在嚴(yán)格條件下與6)-8)任一所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列6所示 的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0041] 10)與6)_9)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列6所 示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0042] 上述嚴(yán)格條件可為用6 X SSC，0.5 % SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0043]其中，序列1由3217個(gè)核苷酸組成，為所述PAB4基因在擬南芥基因組中序列，其中 第455-666位、第 786-869位、第 1527-1623位、第 1702-1794位、第 1885-1965位、第 2101-2201 位、第2370-2452位、第2636-2728位均為內(nèi)含子序列；序列2由2373個(gè)核苷酸組成，為所述 PAB4基因的cDNA序列，其中第157-2145位為編碼序列(0RF);序列1和序列2均編碼序列表中 序列3所示的蛋白質(zhì)，序列3由662個(gè)氨基酸殘基組成。
[0044] 序列4由3568個(gè)核苷酸組成，為所述PAB8基因在擬南芥基因組中序列，其中第556- 886位、第 1006-1141 位、第 1799-1883位、第 1962-2062位、第 2153-2243位、第 2379-2455位、 第2651-2738位、第2943-3031位均為內(nèi)含子序列；序列5由2570個(gè)核苷酸組成，為所述PAB8 基因的cDNA序列，其中第261-2276位為編碼序列(0RF);序列4和序列5均編碼序列表中序列 6所示的蛋白質(zhì)，序列6由671個(gè)氨基酸殘基組成。
[0045] 在上述應(yīng)用或方法中，所述植物既可為雙子葉植物，也可為單子葉植物。
[0046] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述植物為雙子葉植物，進(jìn)一步為十字花科植物，具體 為擬南芥，更加具體為擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型）。
[0047] 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，從擬南芥生物研究中心(ABRC)獲得的PAB4和PAB8基因雙敲除突 變體對(duì)NaCl耐受性增強(qiáng)；因此，可利用PAB4和PAB8調(diào)節(jié)植物對(duì)NaCl的耐受性。另外，也可通 過基因工程手段(RNAi技術(shù))獲得PAB4和PAB8低表達(dá)、耐鹽轉(zhuǎn)基因作物。本發(fā)明符合可持續(xù) 農(nóng)業(yè)發(fā)展需求，對(duì)于研究植物耐受NaCl分子機(jī)制、改良遺傳特性，培育高效耐鹽新品種等方 面具有重要的實(shí)用價(jià)值和市場(chǎng)前景。
【附圖說明】
[0048] 圖1為PAB4和PAB8基因 T-DNA插入雙突變體pab4-l pab8-l的鑒定。圖中WT代表擬 南芥野生型，即Col-Ο生態(tài)型；圖中4/8代表pab4-l pab8-l雙突變體。從圖中可以看出， pab4_l pab8_l雙突變體植株為純合體植株。
[0049] 圖2為用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PAB4基因 T-DNA插入突變體pab4-l中PAB4基因表達(dá) 量的分析結(jié)果。從圖中可以看出，pab4-l突變體為PAB4基因敲除突變體。
[0050] 圖3為用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PAB8基因 T-DNA插入突變體pab8-l中PAB8基因表達(dá) 量的分析結(jié)果。從圖中可以看出，pab8-l突變體為PAB8基因敲除突變體。
[0051 ] 圖4為用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)pab4-l pab8-l雙突變體中PAB4和PAB8基因表達(dá)量 的分析結(jié)果。圖中WT代表擬南芥野生型，即Col-ο生態(tài)型；圖中pab4/8代表pab4-lpab8-l雙 突變體。從圖中可以看出，pab4-l pab8-l雙突變體為PAB4和PAB8基因雙敲除突變體。
[0052] 圖5為NaCl對(duì)pab4_l pab8_l雙突變體幼苗生長(zhǎng)的影響分析結(jié)果。圖中pab4/8代表 pab4_l pab8_l雙突變體。
【具體實(shí)施方式】
[0053]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0054]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商