、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶
[0038] 試劑可以是制成干粉，溶解后使用;或是配成液體試劑，可以直接使用。
[0039] 也可以將上述雙劑試劑配成如下三劑試劑：
[0040] 試劑 1 [0041 ]緩沖液、SAM [0042]試劑2
[0043]緩沖液、甲基受體
[0044] 試劑3
[0045] 緩沖液、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶
[0046] 試劑可以是制成干粉，溶解后使用;或是配成液體試劑，可以直接使用。
[0047] 本發(fā)明還提供了前述檢測TPMT酶活力的組合產(chǎn)品在制備用于分析樣本中巰嘌呤 甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活力的產(chǎn)品或器械中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述樣本選自生物組織、體液和細(xì)胞 中的一種或多種。更優(yōu)選地，所述生物組織選自心、胎盤、胰腺、小腸、腎和肝臟中的一種或 多種，所述細(xì)胞為血細(xì)胞。再優(yōu)選地，所述血細(xì)胞為紅細(xì)胞。
[0048]本發(fā)明還提供了前述檢測TPMT酶活力的組合產(chǎn)品在制備用于分析、檢測和診斷待 測樣本中的巰嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活力異常導(dǎo)致的各種疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用;所述疾病優(yōu) 選為巰嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活力異常導(dǎo)致的各種遺傳和代謝疾病;或制備用于臨床檢測或 診斷與巰嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活力相關(guān)的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0049]本發(fā)明還提供了前述檢測TPMT酶活力的組合產(chǎn)品在制備用于指導(dǎo)與巰嘌呤甲基 轉(zhuǎn)移酶的酶活力相關(guān)的藥物使用的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0050] 本發(fā)明所述檢測ΤΡΜ?1酶活力組合產(chǎn)品的檢測方法包括：
[0051] (1)將含TPMT的樣本與S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM)和甲基受體接觸以形成S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)和甲基受體的甲基化產(chǎn)物，
[0052] (2)通過將所述SAH與SAH水解酶相接觸以生成高半胱氨酸(Hey)和腺苷(Ado)，采 用光度計(jì)評估所述Ado的產(chǎn)生速率以檢測所述樣本中所述TPMT的酶活力。
[0053] 優(yōu)選地，根據(jù)前述的TPMT酶活力檢測方法，其中，所述甲基受體選自帶巰基的芳香 族化合物和帶巰基的雜環(huán)化合物中的一種或兩種。優(yōu)選地，所述甲基受體選自巰基嘌呤、巰 基嘌呤類似物和巰基嘌呤衍生物中的一種或多種。更優(yōu)選地，所述甲基受體選自巰基嘌呤、 咪唑硫嘌呤、6-硫鳥嘌呤、6-硫鳥嘌呤核苷酸、硫肌苷單磷酸鹽、硫肌苷三磷酸鹽、2-硫尿嘧 啶、2-硫胸腺嘧啶、巰基乙醇、溴苯硫酚、鄰氨基苯硫醇、氯苯硫酚、氟苯硫酚、硫代苯甲酸和 巰基嘌呤核苷酸中的一種或多種。最優(yōu)選為6-硫鳥嘌呤。
[0054] 更優(yōu)選地，根據(jù)前述的TPM頂每活力檢測方法，其中，所述方法包括：
[0055] (1)所述含TPMT的樣本、所述SAM和所述甲基受體混合并反應(yīng)獲得反應(yīng)液1;
[0056] (2)將所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶加入步驟（1)中的所述反應(yīng)液1中并反 應(yīng)，獲得反應(yīng)液2;
[0057 ] (3)將步驟(2)中所述的反應(yīng)液2離心獲得上清液；
[0058] (4)采用光度計(jì)檢測步驟(3)中所述的上清液的光吸收值，間接或直接地評估所述 Ado的產(chǎn)生速率以檢測所述樣本中所述TPMT的酶活力。
[0059]再優(yōu)選地，根據(jù)前述的TPMT酶活力檢測方法，其中，所述方法包括:在步驟(1)過程 和步驟(2)過程中加入緩沖液。優(yōu)選地，所述緩沖液為乙酸鈉/乙酸、檸檬酸/檸檬酸鈉、磷酸 氫鹽/檸檬酸(鹽）、磷酸鹽、檸檬酸/氫氧化鈉/鹽酸、MES、M0PS、HEPES、Tri s-鹽酸、硼酸-硼 砂緩沖液中的一種或多種。最優(yōu)選為磷酸鉀緩沖液。
[0060] 還優(yōu)選地，根據(jù)前述的ΤΡΜ?1酶活力檢測方法，其中，所述緩沖液為10~lOOOmmol/ 1^，優(yōu)選為25~1001111]1〇1凡，最優(yōu)選為301]11]1〇1凡;所述甲基受體為0.002~101]1111〇1凡，優(yōu)選為 0 · 05~0 · 5mmol/L，最優(yōu)選為0 · 2mmol/L;所述S-腺苷-L-甲硫氨酸0 · 02~2mmol/L，優(yōu)選為 0 · 05~0 · 5mmol/L，最優(yōu)選為0 · lmmol/L;及所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶0.01~ 100KU/L;優(yōu)選為0.1 ~50KU/L，最優(yōu)選為 10KU/L。
[0061] 或還優(yōu)選地，根據(jù)前述的TPMT酶活力檢測方法，其中，步驟（1)中所述反應(yīng)的條件 為置于30°C環(huán)境中溫浴60min。優(yōu)選地，步驟(2)中所述反應(yīng)的條件為置于30°C環(huán)境中溫浴 1 Omin。更優(yōu)選地，步驟(3)中所述離心為10，000g離心10分鐘。
[0062]或還優(yōu)選地，根據(jù)前述的TPMT酶活力檢測方法，其中，所述方法還包括在步驟（1) 前將所述含TPMT的樣本進(jìn)行前期處理，所述前期處理為所述含TPMT的樣本與試劑混合，所 述試劑為油酸、膽酸鹽、Tween 20、Brij35或牛磺膽酸鈉。優(yōu)選地，所述試劑在上述混合后， 達(dá)到的體積百分濃度為〇. 05-1 %。最優(yōu)選為0.5%。
[0063]進(jìn)一步優(yōu)選地，根據(jù)前述的ΤΡΜ?1酶活力檢測方法，其中，所述方法還包括，在所述 前期處理后，將所述含TPMT的樣本在冰上放置30min。
[0064]優(yōu)選地，根據(jù)前述的TPMT酶活力檢測方法，其中，所述SAM由三磷酸腺苷，甲硫氨酸 和S-腺苷甲硫氨酸合成酶(EC 2.5.1.6)組成的酶反應(yīng)系統(tǒng)所生成。
[0065]優(yōu)選地，根據(jù)前述的ΤΡΜ?1酶活力檢測方法，其中，所述含TPMT的樣本選自生物組 織、體液和細(xì)胞中的一種或多種。優(yōu)選地，所述生物組織選自心、胎盤、胰腺、小腸、腎和肝臟 中的一種或多種，細(xì)胞為血細(xì)胞。最優(yōu)選地，所述血細(xì)胞為紅細(xì)胞。
[0066]具體地，本發(fā)明提供一種ΤΡΜ?1酶活力檢測方法，其基本實(shí)施過程如下：
[0067] TPMT能夠利用S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM)作為甲基供體，將SAM的甲基轉(zhuǎn)移到甲基 受體上，生成甲基受體的甲基化產(chǎn)物，同時(shí)SAM轉(zhuǎn)化為S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)，SAH在 S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶(SAHase，EC 3.3.1.1)的作用下產(chǎn)生腺苷(Ado)，產(chǎn)生的Ado 的速率與SAM的減少速率成正比，評估所述Ado的產(chǎn)生速率可以檢測TPMT的酶活力。所述甲 基受體為帶巰基的芳香族化合物或帶巰基的雜環(huán)化合物及其衍生物，優(yōu)選地，所述甲基受 體為巰基嘌呤或巰基嘌呤類似物及其衍生物。
[0068]可以直接評估所述Ado的產(chǎn)生速率。如Ado在紫外特定波長條件下具有特異性光吸 收，評估所述Ado的生成速率可以間接評估SAM的減少速率，進(jìn)而計(jì)算出待測樣本中TPMT的 酶活力。
[0069]本發(fā)明所述的ΤΡΜ?1酶活力檢測方法的原理可以簡化如圖1。
[0070]本發(fā)明所述的檢測ΤΡΜ?1酶活力的組合產(chǎn)品可以用于分析和檢測各種待測樣本中 的巰嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活力，特別是檢測人體各種體液、組織或細(xì)胞樣本中巰嘌呤甲基 轉(zhuǎn)移酶的酶活力，如心、血細(xì)胞、胎盤、胰腺、小腸、腎或肝臟、紅細(xì)胞。
[0071]本發(fā)明所述的檢測TPMT酶活力的組合產(chǎn)品可以用于分析、檢測和診斷待測樣本中 的巰嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活力異常導(dǎo)致的各種疾病，特別是由巰嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活力 異常導(dǎo)致的各種遺傳和代謝疾病。從而可以廣泛應(yīng)用到臨床檢測或診斷與巰嘌呤甲基轉(zhuǎn)移 酶的酶活力相關(guān)的疾病;而且這種巰嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶酶活力檢測方法和試劑還可用于指導(dǎo) 與巰嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活力相關(guān)的藥物使用。
[0072]本發(fā)明所述檢測ΤΡΜ?1酶活力的組合產(chǎn)品中，所述底物S-腺苷-L-甲硫氨酸可以是 已經(jīng)合成好的化合物;此外，還可以由三磷酸腺苷，甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸合成酶(EC 2.5.1.6) 組成的酶反應(yīng)系統(tǒng)所生成。
[0073]本發(fā)明所述檢測ΤΡΜ?1酶活力的組合產(chǎn)品中，所述的S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解 酶(EC 3.3.1.1)可以是各種物種來源的，它包括但不限于是天然提取的，或者是重組表達(dá) 的，或是經(jīng)過改造或修飾的酶，只要它具有催化S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)水解產(chǎn)生腺 苷的功能，均是本發(fā)明所涵蓋的范疇。
[0074]本發(fā)明所述檢測ΤΡΜ?1酶活力的組合產(chǎn)品中，所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶（EC 2.5.1.6) 可以是各種物種來源，它包括但不限于是天然提取的，或者是重組表達(dá)的，或是經(jīng) 過改造或修飾的酶，只要它具有催化三磷酸腺苷和甲硫氨酸反應(yīng)生成S-腺苷-L-甲硫氨酸 (SAM)的功能，均是本發(fā)明所涵蓋的范疇。
[0075]本發(fā)明的檢測ΤΡΜ?1酶活力組合產(chǎn)品具有但不限于以下有益效果：
[0076] (1)與現(xiàn)有技術(shù)放射化學(xué)法相比，本發(fā)明的檢測TPMT酶活力的組合產(chǎn)品前期處理 簡單，對技術(shù)要求不高且不易造成污染。
[0077] (2)與現(xiàn)有技術(shù)HPLC法相比，本發(fā)明的檢測ΤΡΜ?1酶活力的組合產(chǎn)品對設(shè)備要求較 低，操作簡單，檢測快速。
[0078] (3)基于實(shí)施例中的酶活力測定可知，本發(fā)明的檢測ΤΡΜ?1酶活力的組合產(chǎn)品可半 自動(dòng)或全自動(dòng)的分析檢測設(shè)備上使用，且檢測靈敏度高，特異性高。
【附圖說明】
[0079] 以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：
[0080] 圖1示出了本發(fā)明所述檢測ΤΡΜ?1酶活力組合產(chǎn)品的檢測方法原理。
【具體實(shí)施方式】
[0081] 下面通過具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解為，這些實(shí)施例僅僅是 用于更詳細(xì)具體地說明之用，而不應(yīng)理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。
[0082] 以下實(shí)施例中，除具體指明的試驗(yàn)材料、條件以及操作方法外，實(shí)例中所使用的許 多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在上下文中，如果未特別 說明，本發(fā)明所用材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的。
[0083] 以下