簇區(qū)域?qū)υ摬牧系?稻瘟病抗性起到了關(guān)鍵作用。
[0049] 發(fā)明人將'K22'中上述基因簇所在的基因組DNA片段導(dǎo)入到'空育13Γ中，具體 過程如下：
[0050] 前景選擇標(biāo)記的篩選：正向選擇標(biāo)記是在距目標(biāo)基因組DNA(抗稻瘟病基因 DNA) 片段上、下游50kb (在水稻中其遺傳距離為0. 2cM)范圍內(nèi)篩選多型性分子標(biāo)記，獲得與目 標(biāo)基因組DNA片段緊密連鎖的標(biāo)記Pi2-4。負(fù)向選擇標(biāo)記是在距目標(biāo)基因組DNA片段上、下 游500kb (在水稻中其遺傳距離為2cM)范圍內(nèi)篩選多型性分子標(biāo)記，獲得位于目標(biāo)片段上 游約300kb的標(biāo)記RM19814,以及位于目標(biāo)片段下游約430kb的標(biāo)記RM19835。用于PCR擴(kuò) 增上述分子標(biāo)記的具體引物信息見表1。
[0051] 表1前景選擇標(biāo)記信息
[0052]
[0053」 以131'為祀凹末不，'KM'為供1本末不進(jìn)仃澩父和凹父一代，犾得不〒 子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記Pi2_4和負(fù)向選擇標(biāo)記RM19814、RM19835進(jìn)行重組單株選 擇，篩選出5個(gè)在目標(biāo)基因組DNA片段一側(cè)同源重組的單株，并用水稻全基因組育種芯片 RICE6K(ZL 201210055775. X)對(duì)其進(jìn)行背景選擇（Yu 等，2014)。
[0054] 選擇背景回復(fù)較好的重組單株與受體親本'空育13Γ再次回交，獲得BC2Fi種子， 育苗后利用正向選擇標(biāo)記Pi2_4對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有目標(biāo)基因組DNA片段的重組單株， 利用水稻全基因組育種芯片RICE6K對(duì)其進(jìn)行背景選擇。
[0055] 選擇背景回復(fù)較好的單株再次與輪回親本'空育13Γ進(jìn)行回交，獲得BC3Fi種子， 育苗后利用正向選擇標(biāo)記Pi2_4和負(fù)向標(biāo)記RM19814、RM19835對(duì)收獲的種子進(jìn)行目標(biāo)基因 組DNA片段另一側(cè)同源重組片段的篩選，獲得19個(gè)在目標(biāo)片段兩側(cè)重組的單株。利用水稻 全基因組育種芯片RICE60K (PCT/CN2013/000131)對(duì)上述19個(gè)雙側(cè)交換單株進(jìn)行背景和目 標(biāo)片段選擇（Chen等，2014)，篩選到導(dǎo)入目標(biāo)片段較小，且背景回復(fù)好的目標(biāo)單株一個(gè)。
[0056] 選中的單株自交一次，獲得BC3F2，育苗后利用正向選擇標(biāo)記Pi2_4對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)， 選擇含有目標(biāo)基因組DNA片段的單株利用水稻全基因組育種芯片RICE60K對(duì)其進(jìn)行背景選 擇。最終獲得目標(biāo)片段純合，且背景完全回復(fù)的株系1個(gè)，命名為A08-10,芯片檢測(cè)結(jié)果見 圖1。
[0057] 實(shí)施例2 '空育13Γ導(dǎo)入稻瘟病抗性基因后同源重組片段的確定
[0058] 為了確定導(dǎo)入的稻瘟病抗性基因片段大小，同時(shí)為了保護(hù)該導(dǎo)入片段，發(fā)明人對(duì) '空育13Γ導(dǎo)入稻瘟病抗性基因 DNA片段的純合單株進(jìn)行了目標(biāo)基因組DNA片段兩側(cè)同源 重組片段的測(cè)序。首先，通過SNP芯片檢測(cè)結(jié)果初步確定，A08-10抗稻瘟病基因重組DNA 片段區(qū)段上游同源重組片段位于兩個(gè)SNP標(biāo)記R0610095689AG和R0610407176TC之間約 31L 5kb區(qū)域（第6染色體10095689bp~10407176bp)，下游同源重組片段位于兩個(gè)SNP 標(biāo)記 R0610407176TC 和 F0610556569GA 之間約 149. 4kb 區(qū)域（第 6 染色體 10407176bp ~ 10556569bp)。
[0059] 根據(jù)上述確定的兩個(gè)區(qū)間，通過篩選多態(tài)性標(biāo)記和測(cè)序手段，最終將A08-10抗稻 瘟病基因重組DNA片段上游同源重組片段定位于第6染色體的10211342bp到10213053bp 區(qū)間，下游同源重組片段定位于l〇487554bp到10489311bp區(qū)間。
[0060] 在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物，以受體親本'空育13Γ和供體親本'K22'為對(duì)照，對(duì) A08-10、'空育13Γ和'K22'的上述各區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增，以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用Sanger測(cè)序 法進(jìn)行測(cè)序，擴(kuò)增引物及測(cè)序引物見表2,測(cè)序結(jié)果見圖2和圖3。
[0061] A08-10抗稻瘟病基因重組DNA片段上游同源重組片段測(cè)序長(zhǎng)度為1742bp(SEQ ID No. 1)。l-558bp為受體'空育13Γ的基因組區(qū)段，與供體'K22'比較，存在15個(gè)SNP，3個(gè) Indel。559-810bp這一 252bp區(qū)段為同源重組區(qū)段。811-1742bp為供體'K22'基因組片 段，與'空育13Γ比較，存在28個(gè)SNP，4個(gè)Indel，在1174bp處有1個(gè)16bp的缺失。
[0062] A08-10抗稻瘟病基因重組DNA片段下游同源重組片段測(cè)序長(zhǎng)度為1765bp(SEQ ID No. 2)。l-973bp為供體'K22'的基因組區(qū)段，與'空育13Γ比較，存在47個(gè)SNP，6個(gè)Indel， 包括2個(gè)lbp的插入、2個(gè)lbp的缺失、1個(gè)2bp的插入及1個(gè)5bp的插入。974_1262bp這一 289bp區(qū)段為同源重組區(qū)段。1263-1765bp為受體'空育13Γ的基因組區(qū)段，與供體'K22' 比較，存在6個(gè)SNP，4個(gè)Indel，在1487bp處有1個(gè)13bp的插入。
[0063] 將A08-10所含的抗稻瘟病基因重組DNA片段命名為RecA08-10。圖4為RecA08-10 抗稻瘟病基因重組DNA片兩側(cè)同源重組片段的結(jié)構(gòu)圖。（A)為基因上游同源重組片段結(jié)構(gòu) 圖；(B)為基因下游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖。上方堿基為供體'K22'的SNP或InDel標(biāo)記，下 方堿基為受體'空育13Γ的SNP或InDel標(biāo)記?；疑珔^(qū)段為來源于'空育13Γ基因組區(qū) 段，黑色區(qū)段為來源于'K22'基因組區(qū)段，白色區(qū)段為同源重組區(qū)段。橫坐標(biāo)為片段長(zhǎng)度， 以堿基對(duì)數(shù)目（bp)為單位。
[0064] 表2 RecA08-10抗稻瘟病基因重組DNA片段同源重組片段擴(kuò)增及測(cè)序引物信息
[0065]
[0067] 實(shí)施例3 '空育13Γ導(dǎo)入抗稻瘟病基因重組DNA片段后抗性鑒定
[0068] 為了鑒定目標(biāo)單株的抗性效果，對(duì)A08-10、'空育13Γ、谷梅4號(hào)及麗江新團(tuán)黑谷 進(jìn)行室內(nèi)種植，將其培養(yǎng)至3-4葉期后采用如下方法進(jìn)行鑒定：
[0069] 從2013年采集至黑龍江省農(nóng)科院病圃以及黑龍江省七星農(nóng)場(chǎng)的稻瘟病病葉中分 離的10株稻瘟菌菌株作為接種菌株。編號(hào)分別為13-7101、13-7102、13-7103、13-7104、 13-7105、13-7201、13-7202、13-7203、13-7204 和 13-7205。菌株采用紙片法-20°C保存，使 用前將紙片取出至PDA培養(yǎng)基活化（去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g)，5天后取邊 緣1厘米見方大小的新鮮菌絲塊轉(zhuǎn)接至高粱粒培養(yǎng)基中（高粱粒500g加入1. 5L蒸餾水， 煮至沸騰后濾去液體，將高粱粒撈出裝入三角瓶，濕熱滅菌20分鐘），28°C黑暗培養(yǎng)10天 至菌絲長(zhǎng)滿高粱粒，期間每隔一天將高粱粒搖散。然后將高粱粒攤在無菌紗布上，蓋上無菌 的潮濕紗布，在25°C，12h光照條件下培養(yǎng)4-5天至大量孢子產(chǎn)生，用無菌水（含0. 02%吐 溫 20)洗下孢子，等濃度混合 13-7101、13-7102、13-7103、13-7104、13-7105 以及 13-7201、 13-7202、13-7203、13-7204、13-7205成為兩組接種菌株，調(diào)整濃度至5 X 105個(gè)/ml。
[0070] 用兩組孢子分別噴霧接種A08-10、'空育13Γ、谷梅4號(hào)及麗江新團(tuán)黑谷，每組孢 子混合液接種三個(gè)重復(fù)。接種后罩上透明罩子，28°C黑暗培養(yǎng)24h，然后16h光照培養(yǎng)6天 后調(diào)查。調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)為0級(jí)（高抗，HR) :沒有癥狀；1級(jí)（抗，R):很小的褐色病斑；2級(jí)（中 抗，MR):直徑約為1mm的褐色病斑；3級(jí)（MS，中感）：直接約為2-3mm的帶圓形病斑，中央 灰色，邊緣褐色；4級(jí)（感，S):長(zhǎng)約l-3cm的橢圓形病斑，中央灰色，邊緣褐色；5級(jí)（高感， HS):長(zhǎng)且寬的大橢圓形病斑，病斑融合成片，至葉片病死。其中0-2級(jí)為抗病，3-5級(jí)為感 病。接種結(jié)果見表3和圖5。
[0071] 表3 A08-10接種稻瘟菌抗性表現(xiàn)
[0072]
[0073] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0074] 參考文獻(xiàn)：
[0075] [l]Dai 等，Genomic structure and evolution of the Pi2/9 locus in wild rice species. Theor Appl Gene.2010, 121:295-309.
[0076] [2]Qu 等，The broad-spectrum blast resistance gene Pi9 encodes a nucleotide-binding site-Leucine-rich repeat protein and is a member of a multigene family in Rice. Genetics. 2006, 172:1901-1914.
[0077] [3