44] 下述實(shí)施例中的寧春4號(hào)在文獻(xiàn)"Ge P，Ma CY，Wang SL，Gao LY，Li XH，Guo GF，Ma WJ,Yan YM,Comparative proteomic analysis of grain development in two spring wheat varieties under drought stress.Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012,402(3): 1297-1313."中公開(kāi)過(guò)，公眾可從首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院獲得。
[0045] 實(shí)施例1、鑒定小麥品種中是否含有Glu_B3h基因的方法
[0046] 1、DNA 提取
[0047]用CTAB法提取普通小麥葉片的基因組DNA，用ddH20溶解提取的基因組DNA，并將其 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，要求提取的基因組DNA無(wú)明顯雜質(zhì)、條帶清晰、無(wú)降 解。
[0048] 2、PCR 擴(kuò)增
[0049] 以上述步驟1獲得的基因組DNA為模板，采用表1中的分子標(biāo)記Glu-B3hF和Glu- B3hR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0050] 表1、用于鑒定小麥Glu_B3h基因等位變異的分子標(biāo)記
[0051]
[0052] PCR體系為:模板DNA約100ng，Taq Plus酶(天根生化技術(shù)有限公司，ET105)0.5yL， GC buffer II 25yL(Takara，DRR20GC I)，dNTP(Takara，D4030RA)3yL，上、下游引物（引物 序列見(jiàn)表1，濃度1〇μΜ)各lyL，用無(wú)菌超純水補(bǔ)充反應(yīng)體系至50yL。
[0053] PCR 反應(yīng)程序：94°(：，411^11;94°(：，458;57°(：，5〇8 ;72°(：，3〇8;72°(：，1〇11^11，循環(huán)數(shù)為 30,4°C 保溫。
[0054] 3、電泳
[0055] 取6yL步驟2獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加2yL上樣指示劑（lOXLoading Buffer)，1%瓊 脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為881bp的條帶，說(shuō)明該小麥品種中含有 Glu-B3h基因，Glu-B3h基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
[0056] 4、測(cè)序
[0057] 選取部分樣品切膠送公司測(cè)序(北京諾塞基因組研究中心有限公司），進(jìn)一步確認(rèn) 驗(yàn)證擴(kuò)增條帶為目標(biāo)條帶。測(cè)序結(jié)果表明:PCR擴(kuò)增得到大小為881bp的條帶，其核苷酸序列 如序列表中序列3第115-995位核苷酸分子所示。
[0058]因此可以用如下方法鑒定待測(cè)小麥品種中是否含有Glu_B3h基因：
[0059] (1)提取待測(cè)小麥品種的基因組DNA;
[0060] (2)以基因組DNA為模板，采用分子標(biāo)記Glu-B3hF和Glu-B3hR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為881bp，則待測(cè)小麥品種含有或候選含有Glu-B3h基因。 Glu-B3h基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
[0061] 實(shí)施例2、分子標(biāo)記的應(yīng)用
[0062] 一、分子標(biāo)記在鑒定待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠫lu_B3h基因中的應(yīng)用
[0063] 1、用實(shí)施例1中的鑒定待測(cè)小麥品種中是否含有Glu-B3h基因的方法檢測(cè)28個(gè)具 有不同低分子量谷蛋白（LMW-GS)組成的材料(表2中材料編號(hào)1-1~1-28)中是否含有Glu-B3h基因，來(lái)驗(yàn)證實(shí)施例1中的分子標(biāo)記是否正確。
[0064] 檢測(cè)結(jié)果如圖1和表2所示，泳道1-泳道28對(duì)應(yīng)表2中材料編號(hào)1-1~1-28。只有在 含有Glu-B3h基因的材料中能擴(kuò)出881bp的特異條帶，而在其他品種中不能得到條帶，說(shuō)明 本發(fā)明的方法可有效的鑒定待測(cè)小麥品種中是否含有Glu-B3h基因。
[0065] 2、用寧春4號(hào)和普通小麥品系CB037B(含Glu-B3h)進(jìn)行人工雜交，后代分離得到？！ 代，從F2代起用單粒傳法構(gòu)建了雜交后代重組自交系群體(RIL)直到^代，用實(shí)施例1的鑒定 待測(cè)小麥品種中是否含有Glu-B3h基因的方法對(duì)重組自交系后代的樣本材料(公眾可從首 都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院獲得)進(jìn)行檢測(cè)。
[0066] 檢測(cè)結(jié)果如圖2和表2所示。其中，圖2A(SDS-PAGE圖）和圖2B(瓊脂糖凝膠電泳圖） 中的泳道1:CB037B;泳道2:CB037C;泳道3-17對(duì)應(yīng)表2中的編號(hào)2-3~2-17。從圖2和表2可以 看出，只有在含有Glu-B3h基因的材料中能擴(kuò)出881bp的特異條帶，而在其他品種中不能得 到條帶。說(shuō)明本發(fā)明的方法可有效的鑒定待測(cè)小麥品種中是否含有Glu-B3h基因。
[0067]表2、用于檢測(cè)Glu_B3h基因等位變異特異性引物的材料
[0068]
[0069]
[0070] 二、分子標(biāo)記在鑒定待測(cè)小麥加工品質(zhì)中的應(yīng)用
[0071] 對(duì)不同地點(diǎn)（北京和青海）生長(zhǎng)的小麥材料CB037B(含Glu-B3h)和CB037C(不含 Glu-B3h)小麥加工品質(zhì)參數(shù)(吸水率、延伸性、面包重量、面包體積、面包分?jǐn)?shù))進(jìn)行檢測(cè)。檢 測(cè)的具體步驟參考文獻(xiàn) "Wang SL，Yu ZT，Cao M，Shen XX，Li N，Li XH，Ma WJ，Wei0gerber H,Zeller Friedrich,Hsam Sai,Yan YM,Molecular mechanisms of HMff glutenin subunits from IS1 genome of Aegilops longissima positively affecting wheat breadmaking quality.PLoS 0ne,2013,8(4):e58947·" 中的方法。
[0072] 小麥材料CB037B和CB037C的小麥加工品質(zhì)參數(shù)檢測(cè)結(jié)果如表3所示:從表中可以 看出，CB037B(含Glu-B3h)的吸水率、延展性、面包重量、面包體積和面包分?jǐn)?shù)高于CB037C (不含Glu-B3h)。說(shuō)明含有Glu-B3h的材料的小麥加工品質(zhì)參數(shù)都比不含有Glu-B3h的材料 要高，且差異顯著，不含有Glu_B3h基因的小麥加工品質(zhì)下降。由此得出結(jié)論:Glu-B3h基因 對(duì)小麥的加工品質(zhì)具有非常重要的作用。
[0073] 表3、不同地點(diǎn)生長(zhǎng)的CB037B和CB037C的加工品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果比較
[0074]
[0075] 不同小寫(xiě)字母表示差異顯著P = 0.05。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥品種的加工品質(zhì)的方法，包括如下步驟:檢測(cè)待測(cè)小 麥品種中是否含有Glu-B3h基因，含有Glu-B3h基因的小麥的加工品質(zhì)高于不含有Glu-B3h 基因的小麥的加工品質(zhì)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述檢測(cè)待測(cè)小麥品種中是否含有Glu-B3h基因的方法為如下（1)或(2): (1) 直接測(cè)序； (2) 以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)所述PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物確實(shí)所述待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠫lu-B3h基因； 所述PCR擴(kuò)增的引物為如下1)或2): 1) 由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成的 引物對(duì)A; 2) 由序列X所示的單鏈DNA分子和序列Y所示的單鏈DNA分子組成的引物對(duì)B; 所述序列X為將序列1刪除或增加或改變一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，且與序列1具有相同功能 的核苷酸； 所述序列Y為將序列2刪除或增加或改變一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，且與序列2具有相同功能 的核苷酸； 若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為881bp的條帶，則待測(cè)小麥品種含有或候選含有Glu-B3h基因； 若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有大小為881bp的條帶，則待測(cè)小麥品種不含有或候選不含有 Glu-B3h 基因。3. 檢測(cè)待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠫lu-B3h基因的物質(zhì)在鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥品種的加工 品質(zhì)中的應(yīng)用； 或檢測(cè)待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠫lu-B3h基因的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥品種的 加工品質(zhì)的廣品中的應(yīng)用。4. 檢測(cè)待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠫lu-B3h基因的物質(zhì)在小麥育種中的應(yīng)用； 或檢測(cè)待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠫lu-B3h基因的物質(zhì)在制備小麥育種的產(chǎn)品中的應(yīng)用。5. 檢測(cè)待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠫lu-B3h基因的物質(zhì)在選育加工品質(zhì)高的小麥中的應(yīng)用； 或檢測(cè)待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠫lu-B3h基因的物質(zhì)在制備選育加工品質(zhì)高的小麥的產(chǎn)品中 的應(yīng)用。6. -種鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥品種的加工品質(zhì)的產(chǎn)品，為檢測(cè)待測(cè)小麥品種是否含 有Glu-B3h基因的物質(zhì)。7. 根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的應(yīng)用或權(quán)利要求6所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述檢 測(cè)待測(cè)小麥品種是否含有Glu-B3h基因的物質(zhì)為如下1)或2)或3)或4): 1) 由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成的 引物對(duì)A; 2) 由序列X所示的單鏈DNA分子和序列Y所示的單鏈DNA分子組成的引物對(duì)B; 所述序列X為將序列1刪除或增加或改變一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，且與序列1具有相同功能 的核苷酸； 所述序列Y為將序列2刪除或增加或改變一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，且與序列2具有相同功能 的核苷酸； 3) 含有1)所述引物對(duì)A或2)所述引物對(duì)B的PCR試劑； 4) 含有1)所述引物對(duì)A或2)所述引物對(duì)B或3)所述PCR試劑的試劑盒。8. -種選育加工品質(zhì)高的小麥的方法，包括選擇含有Glu-B3h基因的小麥進(jìn)行育種。9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法或權(quán)利要求3-5中任一所述的應(yīng)用或權(quán)利要求6或7所 述的產(chǎn)品或權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述Glu-B3h基因的核苷酸序列如序列表 中序列3所示。10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法或權(quán)利要求3-5中任一所述的應(yīng)用或權(quán)利要求6或7 所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述加工品質(zhì)為吸水率、延展性、面包重 量、面包體積和/或面包分?jǐn)?shù)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種普通小麥低分子量谷蛋白Glu-B3h基因的分子標(biāo)記及應(yīng)用。所述分子標(biāo)記由序列1所示的單鏈DNA分子和序列2所示的單鏈DNA分子組成。實(shí)驗(yàn)證明：通過(guò)該分子標(biāo)記能快速篩選出具有Glu-B3h基因的小麥品種，相應(yīng)的面粉品質(zhì)也會(huì)提高，從而加速含有優(yōu)質(zhì)基因的小麥新品種的育成步伐。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105567824
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610027979
【發(fā)明人】晏月明, 王亞萍, 甄守民, 李小輝
【申請(qǐng)人】首都師范大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2016年1月15日