一種多重核酸層析快速檢測方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸檢測技術領域，具體地，本發(fā)明涉及一種多重核酸層析快速檢測 方法及應用。
【背景技術】
[0002] 隨著分子生物學、基因組學的不斷發(fā)展和完善，核酸擴增技術已逐步應用于很多 病原體的檢測。LAMP技術:環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP)技術，由Notomi等人于2000年建立，其原理是利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶 和針對靶基因的6個不同區(qū)域設計的4條特異性引物，在60~65°C的恒溫條件下對靶基因進 行擴增。整個檢測反應僅需60分鐘，在存在環(huán)引物的情況下，擴增時間可進一步縮短為40分 鐘。其反應敏感性和特異性比PCR方法高，且因擴增全過程在同一溫度下進行，所需儀器設 備低廉，易于攜帶，適于在基層和現(xiàn)場工作中使用，該技術現(xiàn)已成為生命科學領域研究的熱 點之一〇
[0003] 因 LAMP反應體系較為復雜，擴增產(chǎn)物為一系列大小不一的莖環(huán)結構和多環(huán)花椰菜 結構的DNA片段混合物，無法通過直接比對電泳條帶的分子量來區(qū)分產(chǎn)物。目前LAMP產(chǎn)物的 檢測采用肉眼觀察及濁度法檢測焦磷酸鎂白色沉淀，或者在反應體系中加入鎂離子指示劑 羥基萘酚藍或在終產(chǎn)物中加入熒光染料，通過觀察反應前后的顏色變化判定結果，熒光法 檢測時不僅熒光試劑對人體會造成傷害，同時也會導致假陽性問題的出現(xiàn)，從而限制了 LMAP技術的推廣使用，多重LAMP方法更是鮮有報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服以上現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供一種多重核酸層析快速檢測方 法及應用，將RT-LAMP技術、核酸探針雜交技術和膠體金層析技術進行結合，建立了基于膠 體金-LAMP技術的HIV/AIDS和HCV多重核酸快速檢測方法，實現(xiàn)多重LAMP產(chǎn)物的快速檢測。 本發(fā)明包括HIV和HCV RT-LAMP檢測體系的建立和膠體金核酸層析法檢測多重LAMP反應產(chǎn) 物兩個部分。膠體金檢測試紙由樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊組成，所述 樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊由底板的一側依次粘貼。根據(jù)測試線和質 控線的顯色情況進行結果判定，若質控線和測試線均顯色，為陽性結果;若質控線顯色而測 試線不顯色，為陰性結果;若質控線不顯色，為試紙條失效。本研究將核酸探針雜交技術與 膠體金層析法結合，通過膠體金核酸層析法對多重LAMP反應產(chǎn)物進行檢測，檢測過程不需 要昂貴的專業(yè)儀器設備，降低了檢測成本，提供了檢測效率，適用基層醫(yī)療衛(wèi)生單位和大規(guī) 模人群HI V和HCV的早期篩查。
[0005] -種多重核酸層析快速檢測方法，包括以下步驟：
[0006] 步驟1)根據(jù)待測核酸樣品，設計引物并進行合成，中和探針、膜固定探針的制備， 膜固定探針5 '端標記生物素，流動相探針3 '端標記巰基;利用LAMP專用在線引物設計軟件 Primer Explorer V4分別設計待測核酸樣品引物并進行合成，中和探針、膜固定探針的制 備，膜固定探針5 '端標記生物素，流動相探針3 '端標記巰基；
[0007] 步驟2)制備膠體金核酸層析試紙條:將功能化膠體金溶液均勻浸濕金標結合墊， 膜固定探針與鏈霉親和素混勻，室溫陰干，將質控探針中的膜固定探針和檢測探針中的膜 固定探針分別點樣于質控線處和測試線處；
[0008] 步驟3)將步驟1)設計好的引物加入LAMP反應體系中對待測核酸樣品進行恒溫擴 增；
[0009] 步驟4) RT-LAMP擴增反應結束后，將中和探針液加入RT-LAMP反應管中，95 °C水浴 5min，室溫放置30s;
[0010] 步驟5)將膠體金核酸層析試紙條浸至管底，30s后取出觀察結果。
[0011] 優(yōu)選的是，所述步驟2)中的LAMP反應體系總體積為25μ1，反應體系如下： l〇x ThermoPol bul'lcr 2.5μ1 dNTP ( 10 mM each) 2.5μ1 Bct.ainc( I Μ) 2.5μΙ MgS〇4(l〇〇mM) 2.0μΙ
[0012] F3 和 Β3(10μΜ) ^ 0.5μ! 1?Ρ ?? BIP ( ΙΟμΜ) 各 4.0μΙ _AMV 逆轉錄酶（ lOU/μΙ) 0.2μL Bst DNA 聚介酚（lOU/μΙ) Ι.ΟμΙ 樣品 0_8μ1
[0013] dd&O#足至25 μL
[0014] 上述任一方案優(yōu)選的是，所述步驟3)中的恒溫擴增是在62°C溫度下恒溫擴增 60min〇
[0015] 上述任一方案優(yōu)選的是，所述步驟2)中的膠體金核酸層析試紙條包括樣品墊、金 標結合墊、硝酸纖維素包被膜和吸水墊，所述樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素包被膜和吸 水墊均設置在底板上部，硝酸纖維素包被膜上設有膜固定探針。
[0016] 上述任一方案優(yōu)選的是，所述樣品墊和吸水墊設置在底板的兩端，金標結合墊的 一端設置在樣品墊底部另一端延伸至硝酸纖維素包被膜上部，硝酸纖維素包被膜的一端設 置在金標結合墊的下部，另一端設置在吸水墊的下部。
[0017] 上述任一方案優(yōu)選的是，所述硝酸纖維素包被膜上設有測試線和質控線，測試線 和質控線均為直線。
[0018] 上述任一方案優(yōu)選的是，質控線的兩側均設有膜固定探針。膜固定探針包括質控 膜固定探針和檢測膜固定探針，試紙條質控線和檢測線處分別設有質控膜固定探針和檢測 膜固定探針。
[0019] 上述任一方案優(yōu)選的是，所述吸水墊為吸水濾紙。
[0020] 上述任一方案優(yōu)選的是，所述底板為PVC底板。
[0021 ]本發(fā)明還提供一種膠體金核酸層析試紙條的制備方法包括以下步驟：
[0022] 步驟1)制備膠體金溶液:將氯金酸水溶液與檸檬酸三鈉水溶液混合后加熱至沸 騰，用超純水定容，得到膠體金溶液；
[0023] 步驟2)功能化膠體金溶液的制備:取步驟1)中制備的膠體金溶液，離心棄上清，得 到納米金沉淀;流動相探針與吸附緩沖液混勻后加入到納米金沉淀中，將沉淀重懸，再離 心，棄上清;加入吸附緩沖液重懸沉淀，得到功能化膠體金溶液，置4°C備用；
[0024] 步驟3)制備膠體金核酸層析試紙條:用步驟2)的功能化膠體金溶液均勻浸濕金標 結合墊，室溫陰干后，放在底板中；膜固定探針與鏈霉親和素混勻，室溫放置2h后，將質控探 針中的膜固定探針點樣于質控線處，檢測探針中的膜固定探針點樣于測試線處，點樣體積 為0·15μ1〇
[0025] 上述任一方案優(yōu)選的是，質控探針中的膜固定探針和檢測探針中的膜固定探針點 樣體積均為〇.15μ1，點樣后室溫放置2h陰干，置4°C冰箱。
[0026]優(yōu)選的是，所述步驟1)取100mL0.01 %氯金酸水溶液，與2.5mLl %的檸檬酸三鈉水 溶液混合后加熱至沸騰并持續(xù)沸騰5分鐘，冷卻后用超純水定容至100ml容量瓶中，4°C保存 備用。
[0027] 上述任一方案優(yōu)選的是，所述步驟2)中取步驟1)制備好的膠體金溶液lml，4°C 14000rpm離心20min，棄上清，得到納米金沉淀;流動相探針各取6μ1，與82μ1吸附緩沖液混 勻成100μΙ體系，加入到納米金沉淀中，將沉淀重懸，4°C，12h棄上清；加200μ1蒸餾水， 14000rpm離心10min，棄上清;加20μ1吸附緩沖液重懸沉淀，得到功能化膠體金溶液，置4°C 備用。此處流動相探針包括HCV流動相探針、HIV流動相探針和質控探針的流動相探針三種。
[0028] 本發(fā)明還提供一種根據(jù)上述任一項所述的多重核酸層析快速檢測方法在檢測核 酸樣本中的應用。
[0029]本發(fā)明提供一種多重核酸層析快速檢測方法及應用，將RT-LAMP環(huán)介導逆轉錄等 溫擴增技術和核酸探針雜交技術及膠體金層析技術結合，建立了基于膠體金-LAMP技術的 HIV/AIDS和HCV多重核酸層析快速檢測方法，實現(xiàn)多重LAMP產(chǎn)物的檢測。本發(fā)明包括HIV和 HCV RT-LAMP檢測體系的建立和膠體金核酸層析法檢測多重LAMP反應產(chǎn)物兩個部分。膠體 金檢測試紙由樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊組成，所述樣品墊、金標結合 墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊由底板的一側依次粘貼。根據(jù)測試線和質控線的顯色情況進 行結果判定，若質控線和測試線均顯色，為陽性結果;若質控線顯色而測試線不顯色，為陰 性結果;若質控線不顯色，為試紙條失效，該試紙條可廣泛用于各種致病性微生物或病原體 中特異性基因的檢測。本研究將核酸探針雜交技術與膠體金層析技術結合，通過膠體金核 酸層析法對多重LAMP反應產(chǎn)物進行檢測，檢測過程不需要昂貴的專業(yè)儀器設備，降低了檢 測成本，提高了檢測效率，為基層醫(yī)療衛(wèi)生單位和大規(guī)模人群HIV和HCV的早期篩查，提供一 種特異性強、靈敏度高、速度快的核酸檢測方法。
[0030] 本發(fā)明主要具有以下幾個方便的優(yōu)勢：
[0031] (1)特異性強，用于LAMP擴增的4條引物分