一種檢測(cè)人egfr、kras、braf基因突變的引物組合及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及一種檢測(cè)人EGFR、KRAS、BRAF基因突變的引物及其試劑盒，屬于分子生 物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)世界腫瘤研究治療領(lǐng)域權(quán)威機(jī)構(gòu)NCCN推薦，肺癌患者，尤其是非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)患者，建議進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)。EGFR激活突變的存在對(duì)選擇治療用抗癌藥物具 有重要作用。而研究表明，EGFR的某些突變，尤其是它的19號(hào)外顯子缺失突變，21號(hào)外顯子 點(diǎn)突變(L858R)，18號(hào)外顯子點(diǎn)突變，20號(hào)外顯子的點(diǎn)突變(T790M)，與絡(luò)氨酸激酶抑制劑 (TKIs)的療效有高度的相關(guān)性。此外，在部分肺癌病人當(dāng)中，同時(shí)存在著EGFR基因和KRAS基 因的突變，而KRAS基因第2，3，4號(hào)外顯子上的突變與絡(luò)氨酸激酶抑制劑(TKI s)的療效有負(fù) 相關(guān)作用，當(dāng)KRAS基因存在這些類型突變時(shí)，會(huì)對(duì)靶向EGFR的靶向抗癌藥物產(chǎn)生抵抗。同 時(shí)，BRAF基因在肺癌當(dāng)中也存在不同程度的突變。這些突變中最主要的是第1799位核苷酸 上的突變，導(dǎo)致纈氨酸突變成谷氨酸(V600E)，使患者對(duì)抗體類藥物(如西妥昔單抗)產(chǎn)生抗 藥性。因此，檢測(cè)EGFR、BRAF、KRAS基因的突變情況對(duì)指導(dǎo)臨床腫瘤用藥具有重要作用。
[0003] 在檢測(cè)人組織細(xì)胞樣本中EGFR、KRAS、BRAF基因突變的現(xiàn)有技術(shù)中，通常采用探針 技術(shù)對(duì)上述基因突變進(jìn)行檢測(cè)（如廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的EGFR基因檢測(cè)試 劑盒）。采用熒光探針技術(shù)雖然能夠提高檢測(cè)的特異性，但是使用成本過(guò)高，同時(shí)無(wú)法檢測(cè) 新型突變。另外采用熒光探針，通過(guò)突變組探針熒光起峰的Ct值大小進(jìn)行判斷的方法，其缺 陷在于沒(méi)有有效參照物，雖然引入了內(nèi)參，但是內(nèi)參與突變位點(diǎn)并不是同一位點(diǎn)，甚至不是 同一種基因。而且，其Ct值的判斷規(guī)則基于經(jīng)驗(yàn)值，因此在檢測(cè)時(shí)由于樣本提取質(zhì)量等因 素，其檢測(cè)效果并不理想，在實(shí)際應(yīng)用中，可能會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的不一致。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)人EGFR、KRAS、BRAF基因突變的 引物試劑盒。本發(fā)明的試劑盒采用ARMS-PCR技術(shù)對(duì)上述基因突變進(jìn)行檢測(cè)，在ARMS-PCR技 術(shù)中采用SYBR熒光方法，能夠大幅降低成本;同時(shí)通過(guò)優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，在熒光收集階段引入 四步法(81°C收集熒光），采用高性能的DNA聚合酶，最大限度減少非特異干擾，提高檢測(cè)的 可靠性和準(zhǔn)確性。
[0005] 此外，本發(fā)明的試劑盒還引入了雙內(nèi)參系統(tǒng)，提供了雙重判讀規(guī)則，提高了檢測(cè)的 準(zhǔn)確性和靈敏度。
[0006] 本發(fā)明中，所述EGFR、KRAS、BRAF基因突變的突變位點(diǎn)信息如下：
[0007]
ID NO .33所示。
[0014] 所述ARMS引物中，用于擴(kuò)增正常位點(diǎn)的引物和共用引物擴(kuò)增得到對(duì)應(yīng)突變位點(diǎn)的 正?；蛭稽c(diǎn)，作為第二內(nèi)參。
[0015] 上述試劑盒中，還包括如下試劑:DNA聚合酶、10 X DNA聚合酶緩沖液、SYBR-Green-I、高純水、陽(yáng)性對(duì)照品和4種dNTP混合物。
[0016] 優(yōu)選的，所述DNA聚合酶為Taq HS DNA聚合酶。
[0017] 進(jìn)一步的，上述試劑盒中還包括用于對(duì)樣品進(jìn)行桑格測(cè)序的試劑，所述試劑中包 含用于擴(kuò)增EGFR、KRAS和BRAF基因中任意一個(gè)、兩個(gè)或全部的一個(gè)或多個(gè)外顯子區(qū)域的擴(kuò) 增引物對(duì)。
[0018] 其中，用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子18的區(qū)域的擴(kuò)增引物對(duì)如SEQ ID N0.34和SEQ ID NO .35所示；
[0019] 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子19的區(qū)域的擴(kuò)增引物對(duì)如SEQ ID NO.36和SEQ ID NO. 37所示；
[0020] 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子20的區(qū)域的擴(kuò)增引物對(duì)如SEQ ID NO.38和SEQ ID NO. 39所示；
[0021] 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子21的區(qū)域的擴(kuò)增引物對(duì)如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO. 41所示；
[0022] 用于擴(kuò)增KRAS基因的外顯子2的區(qū)域的擴(kuò)增引物對(duì)如SEQ ID NO. 42和SEQ ID NO. 43所示；
[0023] 用于擴(kuò)增KRAS基因的外顯子3的區(qū)域的擴(kuò)增引物對(duì)如SEQ ID NO. 44和SEQ ID NO. 45所示；
[0024] 用于擴(kuò)增KRAS基因的外顯子4的區(qū)域的擴(kuò)增引物對(duì)如SEQ ID NO. 46和SEQ ID NO. 47所示；
[0025] 用于擴(kuò)增BRAF基因的外顯子15的區(qū)域的擴(kuò)增引物對(duì)如SEQ ID NO.48和SEQ ID NO. 49所示。
[0026] 所述用于對(duì)樣品進(jìn)行桑格測(cè)序的試劑中，還包含對(duì)EGFR、KRAS和BRAF基因擴(kuò)增產(chǎn) 物進(jìn)行測(cè)序的測(cè)序引物；其序列分別如SEQ ID N0.34、SEQ ID N0.37、SEQ ID N0.39、SEQ ID N0.41、SEQ ID N0.43、SEQ ID N0.44、SEQ ID N0.46和SEQ ID N0.48所示。
[0027] 作為一種具體的應(yīng)用形式，上述試劑盒的組成包括：用于檢測(cè)人EGFR、KRAS、BRAF 基因突變的ARMS引物、Taq HS DNA聚合酶、Taq HS DNA聚合酶10X緩沖液、SYBR-Green-I (1:30000)、高純水、陽(yáng)性對(duì)照品、4種dNTP混合物和用于對(duì)樣品進(jìn)行桑格測(cè)序的試劑。
[0028]上述試劑盒在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)人EGFR、KRAS、BRAF基因突變的產(chǎn)品中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029]本發(fā)明進(jìn)一步提供一種非診斷目的的利用上述試劑盒檢測(cè)人EGFR、KRAS、BRAF基 因突變的方法，采用上述ARMS引物對(duì)待測(cè)樣品的目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在81°C采集熒光信 號(hào)，根據(jù)Ct值對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判讀，若ACt-l ? ACt_2(差別在1個(gè)循環(huán)內(nèi)），ACt_2>8,則檢 測(cè)結(jié)果為陰性；
[0030] 若ACt-l>ACt_2, ACt_2〈8,則檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。
[0031] 進(jìn)一步的，若Δ ct_2〈4,則為強(qiáng)陽(yáng)性;如果4〈 Δ ct_2〈8,則為弱陽(yáng)性。
[0032] 其中，ACt-l:突變組Ct值減去第一內(nèi)參組Ct值；
[0033] ACt-2:突變組Ct值減去第二內(nèi)參組Ct值。
[0034] 上述方法，所述PCR擴(kuò)增的條件為:95°C預(yù)變性3分鐘；按95°C20秒，68°C25秒，72°C 25秒，擴(kuò)增反應(yīng)15個(gè)循環(huán);再按95°C20秒，64°C20秒，72°C20秒，81°C20秒，擴(kuò)增反應(yīng)30個(gè)循 環(huán)。
[0035]本發(fā)明的有益效果：
[0036] (1)本發(fā)明在ARMS實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)中引入了雙內(nèi)參系統(tǒng)，除了一般的內(nèi)參對(duì)照 外，還增加了和突變位點(diǎn)一致的正常位點(diǎn)參照，即與對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)一致的正?；蛭稽c(diǎn) 作為第二內(nèi)參，這樣能夠確保檢測(cè)的一致性。雙內(nèi)參系統(tǒng)和對(duì)應(yīng)的雙重判讀規(guī)則避免了現(xiàn) 有技術(shù)的缺陷，判讀基于綜合判斷，并不依賴經(jīng)驗(yàn)值，能夠給出更可靠的突變比例數(shù)據(jù)，提 高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，減少了錯(cuò)誤率。
[0037] (2)本發(fā)明在ARMS實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)中，采用SYBR熒光方法，能夠大幅降低檢測(cè)的 成本，同時(shí)通過(guò)優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，在熒光收集階段引入四步法(81度收集熒光），采用高性能的 DNA聚合酶，最大限度減少非特異干擾，提高檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確性。
[0038] (3)本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中，聯(lián)合桑格測(cè)序技術(shù)和ARMS實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)，既能對(duì) 已知基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，又能發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)，保證了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1:EGFR Exon-19-ARMS已知陽(yáng)性樣本實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線圖；
[0040] 圖2:KRAS Exon-2-ARMS已知陽(yáng)性樣本實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線圖；
[0041] 圖3:采用未經(jīng)優(yōu)化的引物檢測(cè)KRAS Exon-4的樣本實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線圖； [0042]圖4:采用經(jīng)優(yōu)化后的引物檢測(cè)KRAS Exon-4的樣本實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線圖；
[0043] 圖5:EGFR Exon-18-ARMS樣本實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線圖；
[0044] 圖6:EGFR Exon-19-ARMS樣本實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線圖；
[0045] 圖7:EGFR Exon-20-ARMS樣本實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線圖；
[0046] 圖8:EGFR Exon-21-ARMS樣本實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線圖；
[0047] 圖9:KRAS Exon-2-ARMS樣本實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線圖；
[0048] 圖10:KRAS Exon-3-ARMS樣本實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線圖；
[0049] 圖11:KRAS Exon-4-ARMS樣本實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線圖；
[0050] 圖12:BRAF Exon-15-ARMS樣本實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線圖；
[0051] 圖13:EGFR E